抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法及应用技术

本申请涉及抗体制备技术领域，提供了一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，该制备方法包括将石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白免疫注射羊驼，通过分离其外周血淋巴细胞的RNA克隆出羊驼抗体VHH基因，进行克隆并构建了纳米抗体免疫文库。利用噬菌体展示技术对免疫文库进行淘选，筛选出抗石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的特异性纳米抗体。该制备方法可以大量制备抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体，且得到的抗体纯度高，抗神经坏死病毒活性强，应用潜力大、前景好，有利于广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法及应用
本申请属于抗体制备的
，尤其涉及一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法及应用。
技术介绍
鱼类病毒性神经坏死病(viralnervousnecrosis,VNN)，也称为病毒性脑病和视网膜病(viralencephalopathyandretinopathy,VER),其病原为神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus,NNV)。NNV属于野田病毒科(nodaviridae)，β野田病毒属(Betanodavirus)，是一种小型无囊膜病毒，衣壳由180个衣壳亚单位组成，其病毒粒子为二十面体对称结构，直径大约25-30nm。NNV基因组包括2条单链正义RNA，RNA1和RNA2。RNA1编码依赖于RNA的RNA聚合酶，能复制病毒基因组，而RNA2则编码病毒唯一的衣壳蛋白的前体。根据RNA2的核苷酸差异，可以将NNV分为四种基因型：赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spottedgroupernervousnecrosisvirus,RGNNV)、黄带鲹神经坏死病毒(stripedjacknervousnecrosisvirus,SJNNV)、条斑星鲽神经坏死病毒(barfinfloundernervousnecrosisvirus,BFNNV)和红鳍东方鲀神经坏死病毒(tigerpuffernervousnecrosisvirus,TPNNV)。VNN病害在世界各地被报道，严重危害了鱼类养殖的发展，被世界动物卫生组织(OfficeInternationalDesEpizooties,OIE)列为重要鱼类病害。我国农业部发文，在2018年里有监测的鱼类疫病中，病毒性神经坏死病阳性样品检出率最高。而我国NNV高发地区主要在海南、广东、福建和中国台湾地区，而大陆地区流行的NNV基因型是RGNNV，其主要爆发在石斑鱼幼苗中，感染的石斑鱼幼苗死亡率可以达到100％，严重危害着石斑鱼养殖。我国沿海大规模网箱养殖的石斑鱼，由于经常性受神经坏死病毒的感染，养殖产业损失巨大。至今尚无有效的特效抗NNV的药物或生物制剂。虽然有多种抗NNV疫苗对鱼体有一定的保护效果，但是在免疫系统还未完善发育的鱼苗中发挥的作用比较有限。病毒粒子衣壳对宿主细胞感染有重要作用，而NNV衣壳蛋白亚单位，其主要包含3个结构域，分别参与了组装病毒粒子时募集RNA，包装衣壳形成病毒粒子，病毒与宿主细胞表面相互作用。通过制备抗NNV衣壳蛋白的抗体可以为病毒感染机制和诊断防治提供参考。目前，已有利用NNV衣壳蛋白制备抗NNV单克隆抗体，或是制备了抗NNV的特异性卵黄抗体，但是上述制备抗体的方法工艺复杂、无法制备大量抗体；且得到的抗体纯度低、成本高、分子量大易降解失活等缺点，不利于使用。
技术实现思路
本申请的目的在于提供一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法及应用，旨在解决现有技术中无法大量制备高纯度的抗石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的纳米抗体的问题。为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：第一方面，本申请提供一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：获取免疫羊驼的外周血淋巴细胞的总RNA，并进行反转录扩增得到cDNA序列；以所述cDNA序列为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将所述羊驼抗体VHH基因与载体连接得到连接产物，将所述连接产物进行转化构建噬菌体展示文库；从所述噬菌体展示文库中淘选获得抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体序列；利用所述抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体序列构建抗体蛋白表达载体，并进行诱导表达和纯化，得到抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体。第二方面，本申请提供一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体，所述抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体采用所述的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法制备得到。第三方面，本申请提供抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体在水产养殖中神经坏死病的检测中的应用。本申请第一方面提供的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，该制备方法包括将石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白免疫注射羊驼。通过分离其外周血淋巴细胞的RNA克隆出羊驼抗体VHH基因，将其克隆并构建了纳米抗体免疫文库。利用噬菌体展示技术对免疫文库进行淘选，筛选出抗石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的特异性纳米抗体。该制备方法可以大量制备抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体，且得到的抗体纯度高，抗神经坏死病毒活性强，应用潜力大、前景好，有利于广泛应用。本申请第二方面提供的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体，该抗体由上述的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法得到的，得到的抗体产量高，纯度高，且具有较强的抗神经坏死病毒活性，应用前景广泛。本申请第三方面提供的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体在水产养殖中神经坏死病的检测中的应用，由于得到的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体纯度高，且具有较强的抗神经坏死病毒活性，因此可以广泛应用于水产养殖中神经坏死病的检测。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本申请实施例2提供的巢式PCR第一轮扩增的琼脂糖凝胶电泳结果。图2是本申请实施例2提供的巢式PCR第二轮扩增的琼脂糖凝胶电泳结果。图3是本申请实施例3提供的VHH-9和VHH-79的序列比对结果。图4是本申请实施例4提供的pET-SUMO-VHH-9载体图谱。图5是本申请实施例4提供的pET-SUMO-VHH-9测序分析结果。图6是本申请实施例4提供的pET-SUMO-VHH-79载体图谱。图7是本申请实施例4提供的pET-SUMO-VHH-79测序分析结果。图8是本申请实施例4提供的融合蛋白的His-Tag和亲和层析对诱导表达的纳米抗体进行纯化后的蛋白电泳结果。图9是本申请实施例5提供的绝对定量标准曲线。具体实施方式为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n获取免疫羊驼的外周血淋巴细胞的总RNA，并进行反转录扩增得到cDNA序列；/n以所述cDNA序列为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将所述羊驼抗体VHH基因与载体连接得到连接产物，将所述连接产物进行转化构建噬菌体展示文库；/n从所述噬菌体展示文库中淘选获得抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体序列；/n利用所述抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体序列构建抗体蛋白表达载体，并进行诱导表达和纯化，得到抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取免疫羊驼的外周血淋巴细胞的总RNA，并进行反转录扩增得到cDNA序列；
以所述cDNA序列为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将所述羊驼抗体VHH基因与载体连接得到连接产物，将所述连接产物进行转化构建噬菌体展示文库；
从所述噬菌体展示文库中淘选获得抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体序列；
利用所述抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体序列构建抗体蛋白表达载体，并进行诱导表达和纯化，得到抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体。


2.根据权利要求1所述的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫羊驼是经重组石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白抗原免疫的羊驼；其中，所述重组石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白抗原的剂量为2.4mg/只。


3.根据权利要求1所述的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，其特征在于，以所述cDNA序列为模板扩增羊驼抗体VHH基因的步骤中，采用巢式PCR扩增羊驼抗体VHH基因，具体包括：
以所述cDNA序列为模板，采用第一上游引物和第一下游引物进行第一轮PCR扩增，得到第一轮扩增产物；其中，第一上游引物为SEQIDNo.1所示，第一下游引物为SEQIDNo.2所示；
以所述第一轮扩增产物为模板，采用第二上游引物和第二下游引物进行第二轮PCR扩增，得到羊驼抗体VHH基因；其中，第二上游引物为SEQIDNo.3所示，第二下游引物为SEQIDNo.4所示。


4.根据权利要求3所述的抗石斑鱼神经坏死病毒纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的体系为：2倍浓度高保真混合酶25μL，模板cDNA序列1μL，第一上游引物1μL，第一下游引物1μL，补充超纯水至50μL；所述第一轮PCR扩增的程序为98℃2min，98℃10s，55℃5s，72℃30s，33个循环；72℃3min，4℃保存；
所述第二轮PCR扩增的体系为：2倍浓度高保真混合酶25μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓利，周培展，曾子诚，杨晓东，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44