【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在减少的扩增时间下使用巢式重叠引物的指数基数-3核酸扩增相关申请的交叉引用本申请要求于2018年10月29日提交的美国临时专利申请No.62/752,269和2018年10月29日提交的美国临时专利申请No.62/752,276的权益，其全部内容通过引用的方式纳入本文。在联邦资助的研究和开发下所作专利技术的权利的声明不适用。
本文所述的方法和组合物通常涉及核酸扩增领域。特别地，本文所述为用于提高扩增效率的方法和组合物。
技术介绍
多种核酸扩增方法是可获得的，并且许多方法已用于实现基于核酸检测的灵敏诊断测定。聚合酶链式反应(PCR)仍然是最广泛使用的DNA扩增和定量方法。巢式PCR(一种两步PCR)用于提高PCR的特异性和灵敏度(美国专利No.4,683,195)。用于PCR扩增的巢式引物为具有与靶序列上反向引物和正向引物靶向位点之间的区域互补的序列的寡核苷酸。然而，PCR通常具有若干限制。PCR扩增在每个循环中仅能够实现靶序列量的不足两倍的增加。其仍然是相对较慢的。此外，该方法的灵敏度...
【技术保护点】
1.一种用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包含第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包含这样的寡核苷酸，其为至少两种能够与所述第一模板链杂交的第一引物形式或能够形成至少两种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少两种第一引物包含第一外引物和第一内引物，/n所述第一外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a，引物序列a包含一个或多个第一经修饰的碱基；并且/n所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181029 US 62/752,269;20181029 US 62/752,2761.一种用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包含第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包含这样的寡核苷酸，其为至少两种能够与所述第一模板链杂交的第一引物形式或能够形成至少两种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少两种第一引物包含第一外引物和第一内引物，
所述第一外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a，引物序列a包含一个或多个第一经修饰的碱基；并且
所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：
引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；和
夹持序列c，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’，其中夹持序列c不与第一链模板序列d’互补，所述序列d’邻近于第一链模板序列a’并且是第一链模板序列a’的3’；
其中双链引物序列的第二链包含引物序列c’，其邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’，其中联合序列c’-a’与联合序列c-a互补，引物序列a’包含一个或多个第二经修饰的碱基；并且
其中第一和第二经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第二经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第二经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物组还包含至少一种第二引物，其能够与所述第二模板链特异性杂交。
3.一种用于扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包含第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述方法包括：
(a)使所述样品与以下接触：
(i)至少两种第一引物，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少两种第一引物包括第一外引物和第一内引物，
所述第一外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a，引物序列a包括一个或多个第一经修饰的碱基；并且
所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：
引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；和
夹持序列c，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’，其中夹持序列c不与第一链模板序列d’互补，所述序列d’邻近于第一链模板序列a’并且是第一链模板序列a’的3’；
其中双链引物序列的第二链包含引物序列c’，其邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’，其中联合序列c’-a’与联合序列c-a互补，引物序列a’包含一个或多个第二经修饰的碱基；
其中第一和第二经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第二经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第二经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；和
(ii)至少一种第二引物，其能够与所述第二模板链特异性杂交，
其中所述接触是在其中引物退火至它们的模板链的条件下进行(如果存在)；以及
(b)在其中发生链置换的条件下，(如果存在)使用缺少5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶扩增靶核酸以产生扩增子，所述扩增子包含从模板序列a’延伸至所述第二引物结合位点的序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述DNA聚合酶在85摄氏度以上是稳定的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列c-a的Tm高于双链形式的联合序列a-b的Tm。
6.根据前述权利要求中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列c-a比联合序列a-b更富含GC和/或包含更多稳定的碱基。
7.根据前述权利要求中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少3循环数的速率扩增靶核酸，或所述方法在扩增的指数期中以至少3循环数的速率扩增靶核酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组或方法允许以这样的扩增循环检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约12％-42％。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的引物组或方法，其中所述第二引物包含至少两种第二引物形式的或能够形成至少两种第二引物的寡核苷酸，所述第二引物能够与所述第二模板链杂交，其中所述至少两种第二引物包含第二外引物和第二内引物，
所述第二外引物包含与第二模板链序列e’特异性杂交的引物序列e，引物序列e包括一个或多个第三经修饰的碱基；并且
所述第二内引物包含与第二模板链序列f’特异性杂交的单链引物序列f，其中f’邻近于e’并且是e’的5’，并且其中单链引物序列f在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：
引物序列e，其邻近于单链引物序列f并且是单链引物序列f的5’；和
夹持序列g，其邻近于引物序列e并且是引物序列e的5’，其中夹持序列g不与第二链模板序列h’互补，所述序列h’邻近于第二模板链序列e’并且是第二模板链序列e’的3’；
其中双链引物序列的第二链包含引物序列g’，其邻近于引物序列e’并且是引物序列e’的3’，其中联合序列g’-e’与联合序列g-e互补，引物序列e’包含一个或多个第四经修饰的碱基；并且
其中第三和第四经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第三和第四经修饰的碱基之间的配对相比，第三和第四经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
10.根据权利要求9所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列g-e的Tm高于双链形式的联合序列e-f的Tm。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列g-e比联合序列e-f更富含GC和/或含有更多稳定的碱基。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少6循环数的速率扩增靶核酸，或所述方法在扩增的指数期中以至少6循环数的速率扩增靶核酸。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的引物组或方法，其中引物组或方法允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约36％-66％。
14.根据前述权利要求中任一项所述的引物组或方法，其中夹持序列c和g(如果存在)不能在扩增过程中被复制。
15.根据权利要求14所述的引物组或方法，其中夹持序列c和/或g(如果存在)包含2’-O-甲基RNA。
16.根据前述权利要求中任一项所述的引物组或方法，其中所述第一内引物和/或所述第二内引物(如果存在)的双链引物序列不包含发夹序列。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的引物组或方法，其中所述第一内引物的双链引物序列包含发夹序列，在该发夹序列中夹持序列c连接至互补序列c’，和/或所述第二内引物的双链引物序列(如果存在)包含发夹序列，在该发夹序列中夹持序列g连接至互补序列g’。
18.一种用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包含第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包含至少三种第一引物形式的或能够形成至少三种第一引物的寡核苷酸，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少三种第一引物包括第一外引物、第一中间引物和第一内引物，
所述第一外引物包含与第一模板链序列d’特异性杂交的引物序列d，引物序列d包含一个或多个第一经修饰的碱基；
所述第一中间引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的单链引物序列a，其中a’邻近于d’并且是d’的5’，引物序列a包含一个或多个第二经修饰的碱基，其中单链引物序列a在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：
引物序列d，其邻近于单链引物序列a并且是单链引物序列a的5’；和
夹持序列c1，其邻近于引物序列d并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c1不与第一模板链序列i’互补，该第一模板序列i’邻近于第一模板链序列d’并且是第一模板链序列d’的3’；
其中双链引物序列的第二链包含引物序列c1’，其邻近于引物序列d’并且是引物序列d’的3’，其中联合序列c1’-d’与联合序列c1-d互补，引物序列d’包含一种或多种第三经修饰的碱基；并且
所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：
引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；
引物序列d，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’；和
夹持序列c2，其邻近于引物序列d并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列i’互补；
其中内引物的双链引物序列的第二链包含邻近于引物序列d’并且是引物序列d’的3’的引物序列c2’，所述引物序列d’邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’，引物序列a’包含一个或多个第四经修饰的碱基，其中联合序列c2’-d’-a’与联合序列c2-d-a互补；
其中第一和第三经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第三经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第三经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；并且
其中第二和第四经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第二和第四经修饰的碱基之间的配对相比，第二和第四经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
19.根据权利要求18所述的引物组，其中所述引物组还包含至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物。
20.一种用于扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包含第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链(如果存在)与所述第一模板链互补，所述方法包括：
(a)使所述样品与以下接触：
(i)至少三种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少三种第一引物包括第一外引物、第一中间引物和第一内引物，
所述第一外引物包含与第一模板链序列d’特异性杂交的引物序列d，引物序列d包含一个或多个第一经修饰的碱基；
所述第一中间引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的单链引物序列a，其中a’邻近于d’并且是d’的5’，引物序列a包括一个或多个第二经修饰的碱基，其中单链引物序列a在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：
引物序列d，其邻近于单链引物序列a并且是单链引物序列a的5’；和
夹持序列c1，其邻近于引物序列d并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c1不与第一模板链序列i’互补，该序列i’邻近于第一模板链序列d’并且是第一模板链序列d’的3’；
其中...
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