一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法。引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物。检测方法为：(1)提取大熊猫血液DNA，备用；(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用外引物对进行第一轮PCR；(3)以第一轮PCR产物为模板，采用内引物对进行第二轮PCR，然后凝胶电泳并判断是否含有巴贝斯虫。本发明专利技术针对大熊猫源巴贝斯虫的18S rRNA为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了缺乏针对大熊猫源巴贝斯虫的分子检测方法，实现对大熊猫巴贝斯虫特异且灵敏的早期诊断方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法
本专利技术属于生物学
，具体涉及一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法。
技术介绍
巴贝斯虫(Babesia)是寄生于脊椎动物红细胞内的顶复门原虫，蜱是主要的传播媒介，红细胞是唯一可感染的宿主细胞。由巴贝斯虫感染引起的巴贝斯虫病，是世界范围性血液原虫病，其主要临床症状为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等。目前已经有100种以上的巴贝斯虫得到鉴定。该病不仅给畜牧业和国民经济造成巨大损失，同时也严重危害了野生动物健康与种群保护，可危害犬科、猫科、浣熊科、鹿科和灵长类等动物，个别种类还有人感染的报告。大熊猫源巴贝斯虫(GenBank:MT256300.1)是在大熊猫血液中发现的一种巴贝斯虫，是首次报告大熊猫感染巴贝斯虫并引起巴贝斯虫病，该巴贝斯虫从亲缘关系树的分析，显著区别于牛巴贝斯虫、犬巴贝斯虫和田鼠巴贝斯虫等中国主要流行的巴贝斯虫病原，其引物并不适用于大熊猫源巴贝斯虫的检测。因此，缺乏针对大熊猫源巴贝斯虫的特异性引物，显著影响大熊猫源巴贝斯虫检出率，目前，急需探索一种用于检测大熊猫源巴贝斯虫的特异性引物和检测方法。针对该病，最基础的检测方法为血液涂片显微镜镜检法，该方法检出率低，也无法辨别虫种，无法做到早期诊断，目前用作急性发病期的辅助检测手段；临床上常使用血清学检测进行巴贝斯虫流行病学研究，但由于市面上没有针对大熊猫的抗体，在检测中使用的抗体存在较大的种属差异性，不能准确的反应出大熊猫感染巴贝斯虫血清学检测的结果；因此在实验室诊断中，最常使用的是分子诊断技术，其中最常用的为普通PCR检测技术，但该方法检测大熊猫巴贝斯虫时会出现低灵敏性的问题，大熊猫带虫量低时会出现漏检等问题，不利于大熊猫源巴贝斯虫的早期诊断。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物及其试剂盒和检测方法，本专利技术针对大熊猫源巴贝斯虫的18SrRNA为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，提供了一种针对大熊猫源巴贝斯虫的套式PCR检测方法，解决了缺乏针对大熊猫源巴贝斯虫的分子检测方法，实现对大熊猫巴贝斯虫特异且灵敏的早期诊断方法。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物，包括如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的外引物，以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的内引物。一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的试剂盒，包括上述引物、PCR反应预混液、阳性对照以及阴性对照。进一步地，PCR反应预混液包括Taq酶、dTNP、Mg2+离子、缓冲液等成分。进一步地，阴性对照为ddH2O。进一步地，阳性质粒中含有大熊猫源巴贝斯虫18SrRNA基因。进一步地，阳性质粒的构建方法为：将扩增产物克隆至pUC19载体，然后与E.coliTOP10感受态细胞混匀后冰浴30min，42℃水浴中热击90s，再迅速置冰上2min，加入700μLLB液体培养基中培养40min，将菌液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，收集含有18SrRNA阳性质粒的大肠杆菌菌株，并用质粒提取试剂盒提取细菌质粒，用BamHI/SalI限制性内切酶剪切质粒，经凝胶电泳鉴定及测序后获得的阳性重组质粒DNA；该阳性质粒中所含有的特异性序列如SEQIDNO.5所示。采用上述引物，或试剂盒对大熊猫源巴贝斯虫进行检测的方法，包括以下步骤：(1)提取大熊猫血液DNA，备用；(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用外引物对进行第一轮PCR；(3)以第一轮PCR产物为模板，采用内引物对进行第二轮PCR，然后凝胶电泳并判断是否含有巴贝斯虫。进一步地，第一轮PCR的反应体系包括：2μL模板DNA、1μL上游外引物、1μL下游外引物、12.5μLPCR预混液，再用ddH2O补足至25μL。进一步地，第一轮PCR的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s；58℃退火45s；72℃延伸1min，共30个循环，末次延伸72℃保持10min，最后4℃保存。进一步地，第二轮PCR的反应体系包括：2μL第一轮PCR产物、1μL上游内引物、1μL下游内引物、12.5μLPCR预混液，再用ddH2O补足至25μL。进一步地，第二轮PCR的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；62℃退火30s；72℃延伸1min，共30个循环，末次延伸72℃保持10min，最后4℃保存。进一步地，步骤(3)中的判断标准为：当阳性对照泳道有385bp大小的条带，且阴性对照泳道没有条带时，表明检测结果有效，含有巴贝斯虫；否则检测结果无效。本专利技术的有益效果：1、本专利技术试剂盒采用自主设计的PCR反应引物对2对，人工合成的阳性质粒作为阳性对照，自主筛选出的适合的反应体系和PCR两轮的反应条件，提供了一种巢式PCR检测方法来检测大熊猫源巴贝斯虫。2、本专利技术试剂盒通过对大熊猫的临床样品进行检测，能够有效检测出大熊猫源的巴贝斯虫，该临床样本的检测也对试剂盒的有效性和临床使用提供了保障。3、本专利技术提供了一种大熊猫源巴贝斯虫18SrNRA阳性质粒及构建方法，该阳性质粒作为阳性对照或阳性质控品，可实现在检测部门和各个饲养单位对大熊猫巴贝斯虫的PCR检测工作。4、该方法与血液涂片显微镜镜检法相比，显著降低漏检率，显著提高大熊猫源巴贝斯虫检测灵敏度和准确性；与血清学检测相比，克服了缺乏大熊猫特异性抗体，显著提高准确性并能即时反映是否携带虫体的情况；与普通PCR检测相比，该方法显著提高检测灵敏度，提高至少1000倍以上；实现了微量大熊猫血液检测，也能获得高检测率的优势，解决了大熊猫血液珍贵，仅用微量血液也能获得优越检测效果，具有显著的灵敏性和实用性，适用于大熊猫血液巴贝斯虫的检测，因此，该方法是最为适用于大熊猫源巴贝斯虫的检测方法之一。5、目前报道的大熊猫会感染的血液寄生虫主要有肝簇虫、弓形虫和巴贝斯虫这三种，排除该检测方法会检测到肝簇虫和弓形虫的可能性才能有效说明本方法的特异性，本专利技术中的检测方法对这三种寄生虫的18SrRNA片段进行了PCR检测，证明了该检测方法仅能检测出巴贝斯虫，无法检测出弓形虫和肝簇虫，证明了本检测方法的特异性，排除其他大熊猫血液寄生虫对其的干扰。6、大熊猫源的针对套式PCR的检测方法，筛选出不同虫株的特异性片段是尤为重要的一步，也是核心内容之一，但目前报告的巴贝斯虫的检测方法的专利中，缺乏适用于大熊猫源巴贝斯虫的序列片段，本专利技术是针对大熊猫源巴贝斯虫的18SrRNA的一段特异性片段，设计特异性引物，能准确有效的进行检测，填补上大熊猫源巴贝斯虫检测的空缺，显著提高敏感性和特异性，实现大熊猫源巴贝斯虫的早期诊断，适用于开展大熊猫巴贝斯虫流行病学调查，对于大熊猫的巴贝斯虫病的控制及预防有重要意义。附图说明图1为本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的外引物，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的引物，其特征在于，包括如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的外引物，以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的内引物。


2.一种用于大熊猫源巴贝斯虫检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物、PCR反应预混液、阳性对照以及阴性对照。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒中含有大熊猫源巴贝斯虫18SrRNA基因。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒的构建方法为：
将大熊猫巴贝斯虫18SrRNA基因扩增产物克隆至pUC19载体，然后转化E.coliTOP10感受态细胞中，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒。


5.采用权利要求1所述引物，或权利要求2或3所述试剂盒对大熊猫源巴贝斯虫进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取大熊猫血液DNA，备用；
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用外引物对进行第一轮PCR；
(3)以第一轮PCR产物为模板，采用内引物对进行第二轮PCR，然后凝胶电泳并判断是否含有巴贝斯虫。


6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳婵娟，刘颂蕊，李运莉，张东升，齐敦武，马锐，邓泽帅，苏小艳，李林，燕霞，侯蓉，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：四川;51