弓形虫RAA-LFD快速检测的引物、探针及检测方法技术

本发明专利技术公开了弓形虫RAA‑LFD快速检测的引物、探针及检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，探针制备；步骤三，恒温扩增；步骤四，靶向检测；步骤五，方法效果检测；本发明专利技术根据弓形虫529基因的特异性保守靶序列设计特异性引物和探针，可以用以定性检测血液样品中的弓形虫529基因，通过采用重组酶介导等温扩增结合横向流动试纸条，能够快速进行检测，通过试纸条可直接读取检测结果，该方法在临床样本检测中特异性与传统荧光定量PCR相当，但与荧光定量PCR相比具有成本小，简便快捷的优点。该方法操作简便、快捷、特异性强、灵敏度高，适于临床样本及实验室快速诊断，便于基层推广使用。

【技术实现步骤摘要】
弓形虫RAA-LFD快速检测的引物、探针及检测方法
本专利技术涉及基因工程
，具体为弓形虫RAA-LFD快速检测的引物、探针及检测方法。
技术介绍
弓形虫病是一种由专性细胞内寄生的弓形虫引起的人畜共患寄生虫病，目前诊断弓形虫常用的方法有病原学、免疫学和分子生物学方法，病原学诊断的主要方法有涂片法、细胞培养法和动物实验法等，涂片法操作简单，在显微镜下观察到弓形虫即可证实，但该方法灵敏度低，易误诊；细胞培养法和动物实验法实验结果可靠，但由于操作复杂、耗时长、成本高，不适合临床使用；临床上诊断是否感染弓形虫病常用免疫学诊断方法，可通过检测人体血清内是否含有弓形虫抗体来判断，主要有酶联免疫吸附试验、免疫酶染色试验、凝集试验和免疫胶体金技术等，虽然这些方法操作容易，可以快速得到结果，但灵敏度和特异性低，容易产生假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供弓形虫RAA-LFD快速检测的引物、探针及检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：弓形虫RAA-LFD快速检测的引物、探针及检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，探针制备；步骤三，恒温扩增；步骤四，靶向检测；步骤五，方法效果检测；其中在上述步骤一中，首先对弓形虫529bp阳性质粒进行测序，然后根据测序结果，利用NCBIPrimerBLAST设计弓形虫529bp基因特异性RAA-LFD检测引物，并选择5对引物进行DNA序列合成；其中在上述步骤二中，首先利用HiScribeT7QuickHighYieldRNASynthesiskit将合成的DNA探针进行体外转录制备，在探针设计时要注意5’端T7启动子序列，将两条DNA退火形成双链，最终浓度为10μM，然后将转录所得的crRNA探针利用RNAXP磁珠进行纯化，并通过Qbuit进行产物浓度测定；其中在上述步骤三中，以样本DNA为模板，采用重组酶介导的等温扩增技术，使用一步法在37℃等温条件下扩增20～40min，并对所得扩增产物采用Q-sep100检测，筛选出合格的引物组合、反应体系和反应条件；其中在上述步骤四中，首先以恒温扩增产物为模板，利用Cas13a核酸酶和制备好的特异性RNA探针进行酶切反应，筛选出最优的RNA探针，采用基因编辑技术进行靶向检测，将试剂混合后，添加1μL步骤三中的扩增产物，在37℃条件下孵育40分钟，然后利用横向流动试纸条稀释液将检测产物稀释10倍后，加到横向流动试纸条上，放置3～5min，并观察结果；其中在上述步骤五中，首先检测RAA-LFD方法的敏感性与特异性，然后使用RAA-LFD方法进行弓形虫临床样本检测。优选的，所述步骤一中，引物包括上游引物、下游引物。优选的，所述步骤二中，引物包括探针引物。优选的，所述步骤一中，扩增子大小为(100-300bp)，引物退火温度为54-67℃，引物大小为30-35bp。优选的，所述步骤三中，单个扩增反应体系为100～500pmol/L浓度的引物，缓冲液25μL，10μmol/L浓度的正向引物2μL、10μmol/L浓度的反向引物2μL，25×SYBRGreenⅠ溶液1μL，1ng/μL浓度的质粒2μL，280nmol/L浓度的MgOAc溶液2.5μL，双蒸水补充体积至50μL。优选的，所述步骤三中，扩增程序：37℃30sec，37℃30sec(收集荧光)，共40cycles；溶解曲线程序：95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec。优选的，所述步骤四中，试剂为45nmol/L浓度的LwCas13a核酸酶、22.5nmol/L浓度的crRNA探针、125nmol/L浓度的RNA报告分子、1μl的RNA酶抑制剂、1mmol/L浓度的ATP、1mmol/L浓度的GTP、1mmol/L浓度的UTP、1mmol/L浓度的CTP和0.6μl的T7聚合酶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术根据弓形虫529基因的特异性保守靶序列设计特异性引物和探针，可以用以定性检测血液样品中的弓形虫529基因，通过采用重组酶介导等温扩增结合横向流动试纸条，能够快速进行检测，通过试纸条可直接读取检测结果，该方法在临床样本检测中特异性与传统荧光定量PCR相当，但与荧光定量PCR相比具有成本小，简便快捷的优点，该方法操作简便、快捷、特异性强、灵敏度高，适于临床样本及实验室快速诊断，便于基层推广使用。附图说明图1为本专利技术的五对引物熔解曲线图；图2为本专利技术的五对引物扩增产物峰图；图3为本专利技术的primer1+probe1组合荧光扩增曲线图；图4为本专利技术的Primer1+Probe3-4-a、Primer3+Probe3-4-a组合荧光扩增曲线图；图5为本专利技术Primer1+Probe3-4-b、Primer3+Probe3-4-b组合荧光扩增曲线；图6为本专利技术的RAA引物用量为400pmoL/L时的检测结果图；图7为本专利技术的RAA引物用量为240pmoL/L时的检测结果图；图8为本专利技术的RAA扩增时间优化检测结果图；图9为本专利技术的RAA-LFD反应检测弓形虫的敏感性结果图；图10为本专利技术的RAA-LFD反应检测弓形虫的特异性结果图；图11为本专利技术的RAA-LFD临床样本检测结果；图12为本专利技术的方法流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1-12，本专利技术提供的一种技术方案：弓形虫RAA-LFD快速检测的引物、探针及检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，探针制备；步骤三，恒温扩增；步骤四，靶向检测；步骤五，方法效果检测；其中在上述步骤一中，首先对弓形虫529bp阳性质粒进行测序，然后根据测序结果，利用NCBIPrimerBLAST设计弓形虫529bp基因特异性RAA-LFD检测引物，并选择5对引物进行DNA序列合成，引物包括上游引物、下游引物，扩增子大小为(100～300bp)，引物退火温度为54～67℃，引物大小为30～35bp；其中，529bp基因序列为：CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTGTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTGTTTTTCTGATTTTTGTTTTTTTTGACTCGGGCCCAGCTGCGTCTGTCGGGATGAGACCGCGGAGCCGAAGTGCGTTTTCTTTTTTTGACTTTTTTTTGTTTTTTCACAGGCAAGCTCGCCTGTGCTTGGAGCCACAGAAGGGACAGAAGTCGAAGGGGACTACAGACGCGATGCCGCTCCTCCAGCCGTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.弓形虫RAA-LFD快速检测的引物、探针及检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，探针制备；步骤三，恒温扩增；步骤四，靶向检测；步骤五，方法效果检测；其特征在于：/n其中在上述步骤一中，首先对弓形虫529bp阳性质粒进行测序，然后根据测序结果，利用NCBI Primer BLAST设计弓形虫529bp基因特异性RAA-LFD检测引物，并选择5对引物进行DNA序列合成；/n其中在上述步骤二中，首先利用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit将合成的DNA探针进行体外转录制备，在探针设计时要注意5’端T7启动子序列，将两条DNA退火形成双链，最终浓度为10μM，然后将转录所得的crRNA探针利用RNAXP磁珠进行纯化，并通过Qbuit进行产物浓度测定；/n其中在上述步骤三中，以样本DNA为模板，采用重组酶介导的等温扩增技术，使用一步法在37℃等温条件下扩增20～40min，并对所得扩增产物采用Q-sep100检测，筛选出合格的引物组合、最佳反应体系和反应条件；/n其中在上述步骤四中，首先以恒温扩增产物为模板，利用Cas13a核酸酶和制备好的特异性RNA探针进行酶切反应，采用基因编辑技术进行靶向检测，将试剂混合后，添加1μL步骤三中的扩增产物，在37℃条件下孵育40分钟，然后利用横向流动试纸条稀释液将检测产物稀释10倍后，加到横向流动试纸条上，放置3～5min，并观察结果；/n其中在上述步骤五中，首先检测RAA-LFD方法的敏感性与特异性，然后使用RAA-LFD方法进行弓形虫临床样本检测。/n...

【技术特征摘要】
1.弓形虫RAA-LFD快速检测的引物、探针及检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，探针制备；步骤三，恒温扩增；步骤四，靶向检测；步骤五，方法效果检测；其特征在于：
其中在上述步骤一中，首先对弓形虫529bp阳性质粒进行测序，然后根据测序结果，利用NCBIPrimerBLAST设计弓形虫529bp基因特异性RAA-LFD检测引物，并选择5对引物进行DNA序列合成；
其中在上述步骤二中，首先利用HiScribeT7QuickHighYieldRNASynthesiskit将合成的DNA探针进行体外转录制备，在探针设计时要注意5’端T7启动子序列，将两条DNA退火形成双链，最终浓度为10μM，然后将转录所得的crRNA探针利用RNAXP磁珠进行纯化，并通过Qbuit进行产物浓度测定；
其中在上述步骤三中，以样本DNA为模板，采用重组酶介导的等温扩增技术，使用一步法在37℃等温条件下扩增20～40min，并对所得扩增产物采用Q-sep100检测，筛选出合格的引物组合、最佳反应体系和反应条件；
其中在上述步骤四中，首先以恒温扩增产物为模板，利用Cas13a核酸酶和制备好的特异性RNA探针进行酶切反应，采用基因编辑技术进行靶向检测，将试剂混合后，添加1μL步骤三中的扩增产物，在37℃条件下孵育40分钟，然后利用横向流动试纸条稀释液将检测产物稀释10倍后，加到横向流动试纸条上，放置3～5min，并观察结果；
其中在上述步骤五中，首先检测RAA-LFD方法的敏感性与特异性，然后使用RAA-LFD方法进行弓形虫临床样本检测。


2.根据权利要求1所述的弓形虫RAA-...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵金红，李媛媛，蒋峰，朱志伟，薛琪琪，邹茗惠，
申请(专利权)人：皖南医学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34