一种疟原虫原位分型检测方法、装置和试剂盒制造方法及图纸

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体为一种基于多重环介导等温扩增的疟原虫原位分型的检测方法、装置和试剂盒。本发明专利技术通过样品贴壁、固定、透膜、两重环介导等温扩增反应及细胞核染色，可同时区分间日疟原虫和恶性疟原虫。本发明专利技术方法能够特异灵敏的对疟原虫进行原位分型，本实验装置可以解决临床样本量不足，弥补光学显微镜检查灵敏度低的问题。此外，本方法方便实验操作和结果观察，节约实验试剂；同时实验配套试剂盒操作简便，和装置匹配度高。本发明专利技术将在疟原虫原位分型和早期感染诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种疟原虫原位分型检测方法、装置和试剂盒
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于多重环介导等温扩增对疟原虫进行原位分型检测的方法、装置及相关试剂盒。
技术介绍
疟原虫是一种原生动物，也是引起疟疾的病原体，其在热带和亚热带地区广泛传播。疟原虫生活史相当复杂，它进入人体后，会进入肝细胞休眠或繁殖；直至肝细胞破裂，释放出裂殖子，侵入红血球；裂殖子在红血球内以血红素维持活力，分裂繁殖，最后把红细胞涨破。裂殖子侵入红血球，是依赖红细胞膜的表面抗原。目前有4个物种会使人类感染疟疾：恶性疟、三日疟、间日疟及卵形疟原虫。在我国，疟疾的主要病原体为间日疟原虫（PV）和恶性疟原虫(PF)。据世界卫生组织统计，每年有超过两亿确诊的疟疾病例，导致近一百万例患者死亡。在疟原虫属的四个种治疗方案有所不同。其中，恶性疟原虫引起的疟疾危险度最高，死亡率最高。为方便后续治疗方案的制定，必须迅速鉴定并与其他疟原虫种区分开来。传统的疟原虫检测方法的金标准是光学显微镜检查。其优点是操作比较简单、成本低、可以直观观察虫体各生长时期的特征，缺点是环状期的诺氏疟原虫与恶性疟原虫形态类似，多数晚期滋养体有成带状，无法靠此方法鉴别诺氏疟原虫；此外，在疟原虫带虫感染阶段，疟原虫密度低，光学显微镜检查容易漏检。显微图像的常规寄生虫学检测的局限性，使得用荧光原位杂交(FISH)检测成为了更好的选择。FISH通过设计疟原虫属特异性探针与目的基因结合，利用荧光来检测疟原虫，FISH检测比姬姆萨染色镜检法更敏感。相较而言，分子生物学方法是一种快速、高效的检测方法。一般利用巢式PCR进行恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫的特异性鉴别。尽管PCR检测十分有效，但套式PCR可能会产生假阳性，易造成气溶胶污染；此外，其涉及繁杂变温程序，结果需要电泳才能观察，而且实验需要有经验的从业人员。因此，开发一种快速、灵敏、简单的检测方法非常必要。对于即时检测而言，恒温扩增是一种理想的方式，如利用重组酶聚合酶扩增(RPA)在37℃下恒温孵育30min可成功扩增出诺氏疟原虫的18SrRNA基因，RPA试验表现出高灵敏度，但此方法也存在不足，其缺点是无法扩增较长的片段；环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）的灵敏度接近或超过巢式PCR，在检测低密度疟原虫时，较其他方法更有优势。LAMP是一种不需要昂贵设备、肉眼观察即能判断结果的方法。微流控芯片是一种控制微小流体的平台，微流控制流体往往具有不同于宏观尺度的流体特性，细胞，大分子（蛋白、核酸等）这些物质在这个尺寸下更容易控制。目前已经有多家公司推出微流控生物芯片来满足了各类实验需求，很有发展前景。针对目前还没有开发出来用于诊断疟原虫的原位分型理想的方法和装置，本专利技术设计了一种快速方便的基于多重环等温扩增进行疟原虫原位分型的检测方法、装置和试剂盒，核酸扩增在恒温下进行，无需热循环，故与荧光PCR相比，此方法的步骤简单快速。采用BstDNA聚合酶进行扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应的抑制物更少，可有效增加反应灵敏度，十分有发展前景。
技术实现思路
为解决现有的疟原虫分型检测灵敏度低、结果不可信以及成本较高的问题，本专利技术提供了一种高灵敏度、反应稳定、节约样本，易于推广的多重环介导等温扩增疟原虫原位分型的检测方法、装置、试剂盒。本专利技术所提供的多重环介导等温扩增检疟原虫原位分型的检测方法，包含样本的贴壁、固定、透膜、扩增和检测几个步骤，并有配套的试剂盒和装置，用于对恶疟原虫和间日疟原虫进行原位分型。本专利技术所提供的方法是基于多重环介导等温扩增反应扩增核酸。本专利技术所提供的多重环介导等温扩增疟原虫原位分型检测装置，总共分为3层，一层玻璃底片，用于细胞培养；一层微流控芯片，用于控制液体、检测反应；一层芯片夹，用于固定芯片与特质玻璃底片。三个部分的结合顺序为微流控芯片-芯片夹-玻璃底片，大小匹配，依次扣紧；其结构参见图1、图2所示。其中：所述微流控芯片上，包括一条微流管道，一个在微流管道端部的进样口，一个在微流管道中部的观察区；每一个微流控芯片小单元的外部尺寸：长度为20mm；宽度为15mm；高度为10mm；内部尺寸：长度为15mm；宽度为1mm；高度为25µm。内部高度25µm可以有效地防止细胞形成多层结构，平铺成单层方便实验。微流控芯片材质可为聚二甲基硅氧烷（PDMS），PDMS透光、透气性好、有弹性、可灭菌、对人体无毒无害，是十分优质的芯片材料。所述玻璃底片上开有孔道，该孔道可以作为进样孔，也可以作为出样孔，作为进样孔，用于从下往上反重力进样；作为出样孔，用于从上往下流出废液，作为出样孔时可在装置下放置吸水纸，废液在机械力和重力作用下流出，让实验过程更流畅。进样和出样方式可以交替进行，以保持细胞更好的贴壁状态，清洗混合更均匀。所述玻璃底片经过亲水修饰处理。具体处理方法可以是多聚赖氨酸包被、胶原蛋白包被、TiO2纳米颗粒修饰、醛基修饰、EDC-NHS处理、氧等离子体处理、环氧基修饰、高碘酸钠氧化，通过枝接基团让玻璃亲水性增加，使细胞更好的贴壁。本专利技术优选多聚赖氨酸报备和氧等离子体修饰。玻璃底片尺寸大小，可允许配置多个微流控芯片单元，同时进行多个反应。所述玻璃底片材质为熔融硅石。微流控芯片与玻璃底片通过加热进行键合，键合条件可以是80℃，过夜。热键合后的微流控芯片与玻璃底片依旧是结合可逆的，在观察时揭下该芯片，方便快捷。所述芯片夹，其结构分为两个部分：第一部分是底片夹，其大小与玻璃底片尺寸适配，用于锚定整个玻璃底片，其上预留商标书写区、标记区和反应区；第二部分微流控芯片夹，其外部尺寸与底片夹中反应区的内部尺寸适配；内部尺寸与每一个微流控芯片单元的外部尺寸适配，用于固定微流控芯片的位置。此外，芯片夹设计有芯片放置扣手，方便放取芯片。底片夹和微流控芯片夹彼此独立又相互契合，组合方便、可多次使用。芯片夹材质为聚苯乙烯。为防所修饰的玻璃底片亲水降低及灰尘污染，三者在使用前是分别真空塑封包装的。本专利技术还提供多重环介导等温扩增疟原虫原位分型检测试剂盒，与上述检测装置配套使用；检测试剂盒包括四个部分：试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C、试剂盒D。其中：试剂盒A中包括：RPMI1640完全培养液、PBS(pH=7.4)、3-5%多聚甲醛、0.5-2％TritonX-100。试剂盒B中包括:BstDNA聚合酶、1mMdNTP混合物、20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mMKCl、0.1%-1%Tween20和2mMMgSO4。试剂盒C中包括2组引物，分别根据间日疟原虫M11926.1CSPgene和恶性疟原虫AY878729.1plasmodiumfalciparumplasmepsin2gene设计。第一组为间日疟原虫引物:PV-F3、PV-B3、PV-FIP和PV-BIP；第二组为恶性疟原虫:PF-F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重环介导等温扩增疟原虫原位分型检测装置，其特征在于，总共分为3层，一层玻璃底片，用于细胞培养；一层微流控芯片，用于控制液体、检测反应；一层芯片夹，用于固定微流控芯片与玻璃底片，三个部分的结合顺序为微流控芯片-芯片夹-玻璃底片，依次扣紧；其中：/n所述微流控芯片，其中包括一条微流管道，一个在微流管道端部的进样口，一个在微流管道中部的观察区；每一个微流控芯片单元的外部尺寸：长度为20mm；宽度为15mm；高度为10mm；内部尺寸：长度为15mm；宽度为1mm；高度为25µm；/n所述玻璃底片上开有孔道，该孔道作为进样孔或作为出样孔；/n所述玻璃底片经过亲水修饰处理；/n所述玻璃底片尺寸大小可同时配置多个微流控芯片单元，进行多个区域反应；/n微流控芯片与玻璃底片通过加热键合；/n所述芯片夹，其结构分为两个部分：第一部分是底片夹，其大小与玻璃底片尺寸适配，用于锚定整个玻璃底片，其上预留商标书写区、标记区和反应区；第二部分微流控芯片夹，其外部尺寸与底片夹中反应区的内部尺寸适配；内部尺寸与每一个微流控芯片单元的外部尺寸适配，用于固定微流控芯片的位置。/n

【技术特征摘要】
1.一种多重环介导等温扩增疟原虫原位分型检测装置，其特征在于，总共分为3层，一层玻璃底片，用于细胞培养；一层微流控芯片，用于控制液体、检测反应；一层芯片夹，用于固定微流控芯片与玻璃底片，三个部分的结合顺序为微流控芯片-芯片夹-玻璃底片，依次扣紧；其中：
所述微流控芯片，其中包括一条微流管道，一个在微流管道端部的进样口，一个在微流管道中部的观察区；每一个微流控芯片单元的外部尺寸：长度为20mm；宽度为15mm；高度为10mm；内部尺寸：长度为15mm；宽度为1mm；高度为25µm；
所述玻璃底片上开有孔道，该孔道作为进样孔或作为出样孔；
所述玻璃底片经过亲水修饰处理；
所述玻璃底片尺寸大小可同时配置多个微流控芯片单元，进行多个区域反应；
微流控芯片与玻璃底片通过加热键合；
所述芯片夹，其结构分为两个部分：第一部分是底片夹，其大小与玻璃底片尺寸适配，用于锚定整个玻璃底片，其上预留商标书写区、标记区和反应区；第二部分微流控芯片夹，其外部尺寸与底片夹中反应区的内部尺寸适配；内部尺寸与每一个微流控芯片单元的外部尺寸适配，用于固定微流控芯片的位置。


2.根据权利要求1所述的多重环介导等温扩增疟原虫原位分型检测装置，其特征在于，所述玻璃底片经过亲水修饰处理，修饰处理方法是多聚赖氨酸包被、胶原蛋白包被、TiO2纳米颗粒修饰、醛基修饰、EDC-NHS处理、氧等离子体处理、环氧基修饰或高碘酸钠氧化，或者通过枝接基团让玻璃亲水性增加，使细胞更好的贴壁。


3.根据权利要求1所述的多重环介导等温扩增疟原虫原位分型检测装置，其特征在于，所述微流控芯片材质为聚二甲基硅氧烷；所述芯片夹材质为聚苯乙烯；所述玻璃底片材质为熔融硅石。


4.一种多重环介导等温扩增疟原虫原位分型检测试剂盒，其特征在于，包括四个部分：试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C、试剂盒D；其中：
试剂盒A中包括：RPMI1640完全培养液、PBS(pH=7.4)、4%多聚甲醛、0.5％-2%TritonX-100；
试剂盒B中包括:BstDNA聚合酶、1mMdNTP混合物、20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mMKCl、0.1%-1%Tween20和2mMMgSO4；
试剂盒C中包括:2组引物，第一组为间日疟原虫引物:PV-F3、PV...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋国栋，赵伟，张童，赵望，刘思秀，卢惠君，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31