去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法技术

本发明专利技术公开了去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法。该方法包括(1)偶联所述载体蛋白的磁珠与所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库进行孵育获得结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠；(2)采用磁性分离去除所述结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠，从而去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体。该方法提高了小分子纳米抗体的筛选效率。

【技术实现步骤摘要】
去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法
本专利技术涉及纳米抗体制备
，尤其是涉及去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法。
技术介绍
1993年Hamers-Casterman等人发现在骆驼体内存在一种特殊的抗体，命名为重链抗体(heavy-chainantibodies，HCAbs)。这种抗体天然缺失轻链，保守区Fc片段与常规抗体相同，而重链上缺失重链恒定区CH1，但是可以表现出完整的抗体结合能力。HCAbs的抗原结合可变区可以很容易基因克隆得到，这部分为重链单域抗体(VHH)，VHH是目前发现的最小的抗体结合单体，大小为15kDa，仅为常规抗体的1/10，为扁长结构，直径约为25nm，长为4nm，比利时Ablynx公司又称其为纳米抗体(Nbs)。目前已有的纳米抗体制备方法是利用噬菌体展示技术将抗体展示于丝状噬菌体表面后进行体外筛选。小分子物质由于没有免疫原性，只有反应原性，因此在进行抗体制备时不能直接用于免疫动物制备抗体。需要通过小分子和载体蛋白进行偶联制备完全抗原，然后将完全抗原用弗式佐剂乳化后免疫骆驼科或鲨鱼科动物。然后提取羊驼外周淋巴细胞总RNA，设计两对兼并引物，通过PCR扩增两种羊驼体内自然存在的重链抗体免疫球蛋白亚型IgG2和IgG3的可变区(VHH)基因片段，重组于噬菌粒中并转化至抑制型E.coli感受态细胞，加入辅助噬菌体后重新组装，分泌到体外，形成噬菌体展示纳米抗体文库。噬菌体展示纳米抗体文库的筛选可以采用固相筛选法。固相筛选法是将抗原靶分子固定于固相介质(免疫管、酶标板等)，加入噬菌体展示纳米抗体文库进行充分结合反应，然后洗涤除去非特异性和低亲和力的噬菌体，洗脱并回收特异性和高亲和力的噬菌体，在E.coli大肠杆菌中扩增后用于下一轮淘选。经过数轮“吸附-洗脱-富集”的生物淘选方法就能够筛选出特异性结合靶标分子的噬菌体展示纳米抗体。由于小分子物质的纳米抗体制备使用的是小分子和载体蛋白偶联的完全抗原，因此在羊驼血清中，不仅有针对小分子的抗体，也有针对载体蛋白的抗体，而且由于载体蛋白抗原决定簇众多，羊驼血清中载体蛋白的抗体数量远多于小分子抗体。相应的噬菌体展示纳米抗体文库中，针对载体蛋白的纳米抗体也远远多于针对小分子的纳米抗体，而这些数量众多的载体蛋白纳米抗体会严重干扰文库中小分子纳米抗体的筛选。因此在小分子物质纳米抗体筛选过程中，如何高效去除载体蛋白的纳米抗体对于小分子纳米抗体的筛选具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法，包括(1)偶联所述载体蛋白的磁珠与所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库进行孵育获得结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠；(2)采用磁性分离去除所述结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠，从而去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体。可选地，根据上述的方法，所述磁珠为表面带有羧基的磁珠。可选地，根据上述的方法，所述偶联所述载体蛋白的磁珠中，所述磁珠的羧基总量和所述载体蛋白的质量比为20∶1至5∶1。可选地，根据上述的方法，所述方法重复步骤(1)-(2)1次以上，如3-6次。可选地，根据上述的方法，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HAS)或血蓝蛋白(KLH)。具体可以小分子物质免疫所用完全抗原的偶联蛋白为准。可选地，根据上述的方法，所述步骤(1)的孵育条件为25-37℃，例如25℃，反应时间为2-3小时，例如3小时，pH值为7.0-9.0，例如pH值为7.4。可选地，根据上述的方法，采用骆驼科动物或鲨鱼科动物制备所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库。可选地，根据上述的方法，偶联所述载体蛋白的磁珠通过将所述磁珠和所述载体蛋白轻柔混匀后，反应3小时获得，期间保持所述磁珠的悬浮状态。上述方法在制备半抗原纳米抗体中的应用也属于本专利技术的保护范围之内。上文中，所述半抗原可为不含氨基酸的小分子。本专利技术所提供的方法将载体蛋白与带羧基的磁珠进行化学偶联，将构建好的噬菌体展示纳米抗体文库与偶联载体蛋白的磁珠进行孵育，文库中的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体就可以与磁珠表面偶联的载体蛋白结合，通过磁性分离结合了表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠，就可以去除文库中的一部分表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体。用新的载体蛋白磁珠将上述步骤重复3-6次，就可以大大降低小分子纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体数量，为后续高效筛选目标小分子纳米抗体提供帮助。本专利技术所提供的偶联所述载体蛋白的磁珠，可以有效去除小分子噬菌体展示纳米抗体文库中的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体，也就是从小分子物质噬菌体展示纳米抗体文库中反向筛选出不必要的表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体，从而提高小分子纳米抗体的筛选效率。附图说明图1为阿特拉津半抗原的合成路径。图2为阿特拉津小分子完全抗原的合成路径。图3为实施例1的磁珠偶联载体蛋白检验及其结果，左侧图为磁珠偶联载体蛋白检验图，右侧为检验结果的OD450nm读数图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。采用EXCEL软件对数据进行处理，实验结果以平均值表示。下述实施例所使用的酶标仪购置于Thermo公司。下述实施例中所用的试验材料，其中小鼠抗牛血清白蛋白(BSA)单抗购于百奥莱博，辣根过氧化物酶标记的抗M13鼠单抗购于成都阿帕克生物有限公司，羧基磁珠(货号为：70102-50，平均粒径为2μm，浓度为10mg/ml)购于苏州海狸生物医学工程有限公司，其他试剂如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。下述使用的免疫原制备方法如下：1.阿特拉津小分子半抗原的合成1)取7.0g(38.04mmol)三聚氯氰溶于40mL四氢呋喃(THF)，反应体系冷却至-10℃。4.48g(75.93mmol)异丙胺溶于15mLTHF，异丙胺溶液缓慢往三聚氯氰溶液里面滴加，滴毕，反应体系升至室温并继续搅拌3小时，薄层色谱TLC(P/E5∶1)监测原料反应完毕。减压浓缩除去大部分THF，反应体系用乙酸乙酯/水分层，收集有机相，有机相用少量0.1NHCl洗涤，有机相干燥浓缩后用石油醚重结晶得白色固体6.8g，收率86.4％。2)1.0g化合物H1a溶于15mLTHF，0.386g(9.65mmol)NaOH和0.497g氨基丁酸(4.83mmo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法，其特征在于：包括/n(1)偶联所述载体蛋白的磁珠与所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库进行孵育获得结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠；/n(2)采用磁性分离去除所述结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠，从而去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体。/n

【技术特征摘要】
1.去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的方法，其特征在于：包括
(1)偶联所述载体蛋白的磁珠与所述半抗原噬菌体展示纳米抗体文库进行孵育获得结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠；
(2)采用磁性分离去除所述结合所述表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体的磁珠，从而去除半抗原噬菌体展示纳米抗体文库中表达载体蛋白纳米抗体的噬菌体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁珠为表面带有羧基的磁珠。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述偶联所述载体蛋白的磁珠中，所述磁珠的羧基总量和所述载体蛋白的质量比为20∶1至5∶1。

【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，何青青，王伟轩，赵亚杰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11