一种对硝基苄基酯酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种对硝基苄基酯酶突变体及其在酶催化dl‑‑薄荷酯的手性拆分制备l‑薄荷醇中的应用。所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型对硝基苄基酯酶在315位进行定点饱和突变获得。本发明专利技术的有益效果主要体现在：①本发明专利技术酯酶突变体无需添加助溶剂，酶催化活性维持较高水平；②在无助溶剂体系下，突变体酶催化的立体选择性较野生型显著提高。将该突变体酶通过大肠杆菌过量表达后用于催化反应，并以10～200g/L的dl‑乙酸薄荷酯为底物，进行水解拆分制备l‑薄荷醇，结果表明l‑乙酸薄荷酯底物转化率>70％，产物l‑薄荷醇的ee

【技术实现步骤摘要】
一种对硝基苄基酯酶突变体及应用(一)
本专利技术涉及一种对硝基苄基酯酶突变体及其编码基因，以及其在酶催化dl-薄荷酯的手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。(二)
技术介绍
薄荷醇是目前需求量最大的环状单萜烯醇类香料，它一共有8种同分异构体，其中l-薄荷醇具有的独特薄荷香气和清凉效果，具有兴奋、杀菌镇痛、止痒、芳香清凉等功能，使得它在各产业中有非常广泛的应用，如食品，烟草，化妆品，口腔保健等产品。其也被广泛用于镇痛剂、局部麻醉剂等医药品以及作为手性化合物合成前体和辅助试剂等。l-薄荷醇的生产方法包括植物提取法、化学合成法和生物酶手性拆分法等。植物提取法是目前l-薄荷醇的重要生产方法，因其具有天然来源的产品特性，备受消费者青睐。但是，其产品质量和价格受原料薄荷叶产地、光照的等多种因素影响。此外，提取液中富含原油杂质，难分离且能耗大，价格波动大。而化学法合成并进行光学拆分，生产成本高，工艺较为复杂，易带入毒性物质，不适合工业化应用。虽然已有化学不对称合成法，但技术难度较高。相较之下，生物酶法反应温和，原料价廉易得，对环境友好等因素推动研究者对生物法手性拆分的研究。现有一个枯草芽孢杆菌来源的酯酶，在水解dl-乙酸薄荷酯手性拆分制备l-薄荷醇中具备良好的优点，包括反应速率快，底物投料量大等，但是其缺点是酶的立体选择性不高，且需要添加助溶剂如乙醇或丁醇等来提高酶的催化速率和催化的立体选择性。因此需要对该酯酶进行定向改造，提高其应用性能。随着酶的晶体结构不断被解析，基于生物信息学的计算模拟技术的不断改进，酶的半理性设计并定向进化和筛选的成功显著提高。已使用的大量工业酶都经过人工改造，特别是在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得很大的成功，主要集中在提高酶热稳定性，提高酶的催化反应活性，改进底物特异性以及提高对映体选择性等。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种立体选择性好的对硝基苄基酯酶突变体及其编码基因，以及其在酶催化dl-乙酸薄荷酯的手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。本专利技术采用的技术方案是：一种对硝基苄基酯酶突变体，由氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的野生型对硝基苄基酯酶在315位进行定点饱和突变获得。酯酶的结构一般都存在两个活性口袋，包括疏水(体积较大)和亲水(体积较小)两个口袋。对于底物dl-薄荷酯，在催化机理中，底物六元环上的异丙基朝向酶催化口袋中的疏水口袋，底物六元环上的甲基则是与酶的亲水口袋相结合。这是一个针对于薄荷酯催化最有利的位置(HolmquistMetal.2010.ProteinScience,5:83-88)，如图2所示(M表示中等取代基，L为大取代基)。通过改变活性口袋周围的残基，从而影响残基侧链效应，改变酶口袋的大小，使得不同底物的异构体与酶结合上造成差异，从而提高酶选择性。SEQIDNO:2所示的野生型对硝基苄基酯酶(PNB)来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCCNo.17904(CN110373366A)，可对dl-薄荷酯实现高效地手性拆分，用于制备l-薄荷醇，特别是其水解速率快，dl-薄荷酯底物投料量高。但是，该酶催化过程中需添加助溶剂如丁醇或乙醇，用来提高底物的立体选择性。若在无助溶剂体系下，酶催化的底物立体选择性较低。而在催化体系中添加有机溶剂，不但增加了生产成本，也增加了产物l-薄荷醇分离纯化的难度。本专利技术通过对野生型酶的突变改造，提高了酶在无助溶剂体系的催化速率，同时显著提高其在无助溶体系下对底物的立体选择性。通过PCR扩增得到该对硝基苄基酯酶PNB基因，将其克隆至大肠杆菌BL21(DE3)的表达载体pET28a，进行酶的过量表达。结合酶三维结构计算模拟，针对酯酶PNB底物结构口袋中对底物立体选择性起到关键作用的氨基酸位点进行饱和突变，再进行酶学比较分析后筛选得到本专利技术酯酶突变体。优选的，所述对硝基苄基酯酶突变体氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还涉及编码所述对硝基苄基酯酶突变体的基因。所述的酯酶突变体PNB-F315E的编码基因，可以根据其氨基酸序列进行密码子优化后合成的基因序列，亦可从B.subtilisCGMCCNo.17904菌株基因组PCR扩增后突变改造的基因序列。优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术还涉及所述对硝基苄基酯酶突变体在酶催化dl-薄荷酯的手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。具体的，所述应用为：构建含有所述突变体编码基因的重组菌，以重组菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶细胞为催化剂，对dl-薄荷酯进行水解，获得l-薄荷醇。可将该酯酶突变体PNB-F315E的基因克隆到表达质粒，并转化到宿主细胞中，经过诱导发酵制作成酯酶制剂后，用于催化dl-薄荷酯选择性水解制备l-薄荷醇。所述的表达质粒和宿主细胞，优选pET28a质粒和大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，即构建重组菌E.coliBL21(DE3)(pET28a-PNB-F315E)。所述水解可在无溶剂条件下进行。优选的，水解反应体系中，细胞密度为5～30OD(优选10OD)，dl-乙酸薄荷酯用量为1％～20％(w/w)(优选15％)，水解过程控制pH6.5～8.5(优选pH8.0)、温度25℃～40℃(优选30℃)。所述dl-薄荷酯优选为dl-乙酸薄荷酯。本专利技术酯酶突变体，在无助溶剂体系下，催化水解1％～20％的dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇，其l-乙酸薄荷酯底物转化率>70％，产物l-薄荷醇的eep值>95％。本专利技术的有益效果主要体现在：①本专利技术酯酶突变体无需添加助溶剂，酶催化活性维持较高水平；②在无助溶剂体系下，突变体酶催化的立体选择性较野生型显著提高。将该突变体酶通过大肠杆菌过量表达后用于催化反应，并以10～200g/L的dl-乙酸薄荷酯为底物，进行水解拆分制备l-薄荷醇，结果表明l-乙酸薄荷酯底物转化率>70％，产物l-薄荷醇的eep值>95％，表现出良好的工业应用性能。(四)附图说明图1为l-薄荷醇、d-薄荷醇、dl-薄荷醇、dl-乙酸薄荷酯的结构示意图。图2为酯酶PNB的底物结合口袋示意图。图3为dl-乙酸薄荷酯、dl-薄荷醇标准样品的GC色谱图。图4为酯酶突变体F315E催化dl-乙酸薄荷酯水解拆分制备l-薄荷醇的催化反应液的GC色谱图。(五)具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面将结合具体实施例对本专利技术做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不对本专利技术的保护范围构成限定。LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl10.0g/L，溶剂为蒸馏水。发酵培养基：酵母粉12.0g/L、蛋白胨15.0g/L、Na2HPO4·12H2O8.9g/L、KH2PO43.4g/L、NH4Cl2.67g/L、Na2SO40.71g/L、MgSO4·7H2O0.49g/L、卡那霉素50μg/L、pH7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对硝基苄基酯酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型对硝基苄基酯酶在315位进行定点饱和突变获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种对硝基苄基酯酶突变体，由氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的野生型对硝基苄基酯酶在315位进行定点饱和突变获得。


2.如权利要求1所述的对硝基苄基酯酶突变体，其特征在所述对硝基苄基酯酶突变体氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。


3.编码权利要求1所述对硝基苄基酯酶突变体的基因。


4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。


5.权利要求1所述对硝基苄基酯酶突变体在酶催化dl-薄荷酯的手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。

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【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，王广强，金晓，胡军，陆跃乐，张翼轸，朱林江，陈志钢，陈翰驰，田雯，朱俊峰，
申请(专利权)人：安徽丰乐香料有限责任公司，浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34