HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用。所述方法包括：i)使用RNP复合体靶向切割细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括sgRNA和Cas9蛋白；ii)使用含有CD17A＞T突变位点位的外源DNA与处理后的基因组DNA进行同源介导修复。本发明专利技术可以提供一种携带HBB基因CD17A＞T突变的细胞，引起的β‑珠蛋白表达缺陷所构建的β‑地中海贫血细胞株的方法，有助于疾病的临床治疗和再生医学研究。

【技术实现步骤摘要】
HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用
本专利技术涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
β-地中海贫血(β-thalassemia)是最常见的单基因遗传病，且分布范围广泛，是遍布全球的遗传性疾病之一。这种病的主要致病机制是β-珠蛋白合成障碍，β-珠蛋白表达量缺乏或严重减少，使α/β-珠蛋白链比率失衡，不能合成具有正常生物功能的血红蛋白四聚体，造成贫血。严重的β-地中海贫血患者体内无效的红细胞生成增多，出现慢性溶血性贫血，代偿性造血机制被激活，代偿性造血功能亢进，出现在骨髓以外的造血点，如肝脏或脾脏，也可以出现在具有造血潜力的任何器官组织，会增加髓外假性肿瘤形成的风险。在无效红系细胞生成的过程中，红系细胞暴露于衰老抗原如磷脂酰丝氨酸，使其容易形成血栓。地中海贫血患者常出现血小板和凝血系统异常，血液呈高凝状态，且出现相关的血管临床症状如静脉血栓和肺动脉高压等，特别是脾切除的患者。此外，无效红细胞生成导致铁吸收增加，出现由肝脏激素介导的原发性铁超负荷。或由于长期输血引起的铁沉积，可使临床本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备HBB基因CD17突变细胞的方法，其特征在于，包括：/ni)使用RNP复合体靶向切割细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA和Cas9蛋白；/nii)使用含有CD17 A＞T突变位点位的外源DNA与处理后的基因组DNA进行同源介导修复。/n

【技术特征摘要】
1.制备HBB基因CD17突变细胞的方法，其特征在于，包括：
i)使用RNP复合体靶向切割细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括核苷酸如SEQIDNO:1的sgRNA和Cas9蛋白；
ii)使用含有CD17A＞T突变位点位的外源DNA与处理后的基因组DNA进行同源介导修复。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源DNA通过rAAV递送至所述细胞以进行同源介导修复。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述rAAV血清型是Ⅵ号血清型。


4.根据权利1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述外源DNA的核苷酸序列为SEQIDNO:2所示。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNP复合体中，所述sgRNA与所述Cas9蛋白的摩尔比为(2～3):1。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述sgRNA与所述Cas9蛋白以电转染的方式导入所述细胞，转染体系中比例，1nmolCas9蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙筱放，程怡，何丽娜，宋兵，杨影虹，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第三医院广州重症孕产妇救治中心，广州柔济医院，
类型：发明
国别省市：广东;44