通过肝导向基因替代疗法治疗严重PKU的改良的人PAH的产生制造技术

本文提供了变体苯丙氨酸羟化酶(PAH)多肽，其比野生型人PAH更稳定并且具有更大的活性。还提供了在有需要的个体中治疗苯丙酮尿症(PKU)和/或降低苯丙氨酸水平的方法。本文还提供了用于在有需要的个体中表达所述变体PAH多肽的表达盒、载体(例如，rAAV载体)、病毒粒子、药物组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过肝导向基因替代疗法治疗严重PKU的改良的人PAH的产生相关申请的交叉引用本申请要求以下申请的优先权益：2018年10月12日提交的美国临时申请序列号62/744,944，其通过引用以其整体并入本文。ASCII文本文件序列表的提交将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：159792016640SEQLIST.TXT，记录日期：2019年10月16日，大小：33KB)。
本公开文本涉及变体苯丙氨酸羟化酶多肽。在一些方面，本公开文本涉及使用基因疗法治疗苯丙酮尿症的组合物和方法。
技术介绍
苯丙酮尿症(PKU)是催化苯丙氨酸(Phe)羟基化为酪氨酸(Tyr)的肝酶苯丙氨酸羟化酶(PAH)的遗传缺陷。这种疾病是氨基酸代谢最常见的先天性缺陷，在北美的总发病率为1:10000-1:15000，并且在大多数发达国家通过新生儿筛查项目检测到。在没有任何治疗的情况下，严重形式的PKU导致高度升高的血液Phe水平，这具有神经毒性，并与严重的精神发育迟滞相关联(Kochhar2012，Ho2014，Blau2015)。受影响的蛋白质PAH是一种多结构域蛋白质，其由N-末端调节结构域(1-117)、中心催化结构域(118-410)和C-末端四聚结构域(411-452)组成(Flydal2013)。迄今为止，已有超过560种致病突变被定位到每个结构域，其中催化区是受影响最频繁的位点(Erlandsen2003)。同源多聚体酶通过结合到N-末端结构域的底物Phe经受磷酸化和变构活化的复杂调节，所述结合通过改变酶的各种构象和多聚体状态来微调PAH酶活性(Knappskog1996，Jaffe2013，Arturo2016)。目前对PKU的治疗是使用低蛋白饮食和液体药物配方对Phe进行终生饮食限制(Kochhar2012，Ho2014，Blau2015)。虽然有效，但药用食物的味道差和对食物选择的严重限制使得儿童难以坚持饮食，且不遵守饮食的情况稳步增加，并且到青少年后期，近80％的患者具有高于推荐水平的血液Phe水平(Waisbren2007，Thomas2017)。也有新的证据表明，尽管很好地坚持Phe限制饮食，但许多患者在各种神经认知和神经精神功能方面存在缺陷，并且注意力缺陷多动障碍(ADHD)的发病率很高。虽然其原因尚不清楚，但潜在的解释包括脑氨基酸失衡、某些维生素和微量元素的营养缺乏，以及通常由肝脏PAH活动维持稳定的血液Phe水平波动(Cleary2013，Gonzales2016，Vogel2017)。有趣的是，用辅因子四氢生物蝶呤(BH4)(沙丙蝶呤二盐酸盐)的合成形式治疗轻度PKU患者不仅显示有效降低血液Phe水平，还表明改善了神经功能，如减少ADHD症状(Burton2015)。这种疗法通过充当药理学分子伴侣来增加残留的PAH酶活性，并且因此可以通过提供正常的Phe调节的PAH活性来部分纠正遗传缺陷(Blau2015)。最近批准的另一种疗法由使用将Phe代谢为反式肉桂酸的细菌苯丙氨酸解氨酶(PAL)的聚乙二醇化形式的酶替代疗法组成。这种疗法显著降低血液Phe水平，但对神经学终点似乎不太有效(Longo2014)。目前还不清楚这种疗法或主要基于降低血液Phe水平的任何其他疗法，在没有纠正作为系统Phe水平调节剂和Tyr产生者的PAH功能的情况下，是否能够解决甚至在顺从饮食的PKU患者中观察到的认知和神经精神问题。本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其整体而并入。
技术实现思路
本专利技术至少部分基于专利技术人发现的改进的hPAH变体，并且特别是变体-1(V1)，其含有四种氨基酸变化，与内源性hPAH相比，导致蛋白质稳定性和酶活性的改进。使用临床相关剂量的rAAV将编码这种hPAH-V1变体的cDNA递送到肝脏改善了人PKU模型PAHenu2小鼠的各种疾病终点，并且比未修饰的hPAH更有效。因此，编码这种新变体的rAAV载体可以通过允许用降低的载体剂量获得功效，来为PKU基因疗法提供途径。在一些方面，本专利技术提供了包含两个氨基酸取代的变体苯丙氨酸羟化酶(PAH)多肽，其中氨基酸取代位于选自野生型人PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位点处。在一些方面，本专利技术提供了包含三个氨基酸取代的变体苯丙氨酸羟化酶(PAH)多肽，其中氨基酸取代位于选自野生型人PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位点处。在一些方面，本专利技术提供了包含四个氨基酸取代的变体苯丙氨酸羟化酶(PAH)多肽，所述氨基酸取代位于野生型人PAH多肽的位点M180、K199、S250和G256处。在一些实施方案中，氨基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A中的一种或多种。在一些实施方案中，氨基酸取代包括K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。在一些实施方案中，氨基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A。在一些实施方案中，变体PAH多肽还包含H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T氨基酸取代。在一些实施方案中，野生型人PAH多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体PAH多肽是人PAH多肽。在一些实施方案中，变体PAH多肽包含与SEQIDNO:3的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体PAH多肽包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体PAH多肽还包含选自野生型人PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体PAH多肽还包含选自野生型人PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H的一个或多个氨基酸取代，以及在野生型人PAH多肽的位置453处添加S。在一些实施方案中，变体PAH多肽还包含选自野生型人PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体PAH多肽包含选自野生型人PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含两个氨基酸取代的变体苯丙氨酸羟化酶(PAH)多肽，其中所述氨基酸取代位于选自野生型人PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位点处。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181012 US 62/744,9441.一种包含两个氨基酸取代的变体苯丙氨酸羟化酶(PAH)多肽，其中所述氨基酸取代位于选自野生型人PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位点处。


2.一种包含三个氨基酸取代的变体苯丙氨酸羟化酶(PAH)多肽，其中所述氨基酸取代位于选自野生型人PAH多肽的M180、K199、S250和G256的位点处。


3.一种包含四个氨基酸取代的变体苯丙氨酸羟化酶(PAH)多肽，所述氨基酸取代位于野生型人PAH多肽的位点M180、K199、S250和G256处。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述氨基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A中的一种或多种。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述氨基酸取代包括K199P、S250P和G256A；M180T、S250P和G256A；M180T、K199P和G256A；或者M180T、K199P和S250P。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述氨基酸取代包括M180T、K199P、S250P和G256A。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽还包含H264P、G272A、G272P、P275L、P279Q、G272P和P275L，或T323R和F327T氨基酸取代。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述野生型人PAH多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽是人PAH多肽。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含与SEQIDNO:3的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。


11.根据权利要求1-6中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。


12.根据权利要求1-11中任一项所述的变体PAH，其中所述变体PAH多肽还包含选自野生型人PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A的一个或多个氨基酸取代。


13.根据权利要求1-12中任一项所述的变体PAH，其中所述变体PAH多肽还包含选自野生型人PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H的一个或多个氨基酸取代，以及在野生型人PAH多肽的位置453处添加S。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的变体PAH，其中所述变体PAH多肽还包含选自野生型人PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P的一个或多个氨基酸取代。


15.一种变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含选自野生型人PAH多肽的G33A、G46A、G46P、G103A、G139A、G139P、G148A、G188A、G218A、G239A、G247A、G257A、G272A、G289A、G307A、G312A、G332A、G337A、G344A、G352A和G442A的一个或多个氨基酸取代。


16.一种变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含选自野生型人PAH多肽的P9G、G10V、G12S、K184R、K192R、S196A、Y206H、H220R、Q336E、E360D、I374C、N376E、N401T、I421V、I441V、S446H的一个或多个氨基酸取代，以及在野生型人PAH多肽的位置453处添加S。


17.一种变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含选自野生型人PAH多肽的F240W、A246P、G247A、Y268W、C284F、T323R、F327Y、E319P、I306(Y、F)、K113P、G188A、F191Y、T193R、Y206H、G337P和N376P的一个或多个氨基酸取代。


18.根据权利要求1-17中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含N-末端截短。


19.根据权利要求18所述的变体PAH多肽，其中所述N-末端截短包括N-末端调节结构域的截短。


20.根据权利要求18或19所述的变体PAH多肽，其中所述N-末端截短包括所述野生型PAH多肽的氨基酸残基1-102的截短。


21.根据权利要求1-20中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含C-末端截短。


22.根据权利要求21所述的变体PAH多肽，其中所述C-末端截短包括四聚结构域的截短。


23.根据权利要求21或22所述的变体PAH多肽，其中所述C-末端截短包括所述野生型PAH多肽的氨基酸残基429-452的截短。


24.根据权利要求1-23中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含对应于所述野生型PAH多肽的氨基酸残基103-428的氨基酸序列。


25.根据权利要求1-24中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含一个或多个氨基酸取代，以消除潜在的蛋白酶切割位点。


26.根据权利要求25所述的变体PAH多肽，其中消除潜在蛋白酶切割位点的所述一个或多个氨基酸取代位于所述野生型PAH多肽的位置270-295和/或380-405处。


27.根据权利要求1-26中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽与肝靶向多肽融合。


28.根据权利要求27所述的变体PAH多肽，其中所述肝靶向多肽是HGF或其片段或者结合肝细胞去唾液酸糖蛋白受体的糖蛋白。


29.根据权利要求1-25中任一项所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽被聚乙二醇化和/或亚硝基化。


30.根据权利要求26所述的变体PAH多肽，其中所述变体PAH多肽包含I374C氨基酸取代，其中位置374处的cys残基被亚硝基化。


31.一种组合物，其包含根据权利要求1-30中任一项所述的变体PAH多肽。


32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。


33.一种分离核酸，其编码根据权利要求1-30中任一项所述的变体PAH多肽。


34.根据权利要求33所述的分离核酸，其中编码所述变体PAH多肽的核酸可操作地连接至启动子。


35.根据权利要求34所述的分离核酸，其中所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子、RSVLTR、MoMLVLTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、mTTR482启动子、mA1MB2-mTTR482启动子、TK启动子、四环素应答性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、LP1启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG)启动子、延长因子1-α启动子(EF1-α)启动子、人β-葡糖醛酸酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、修饰的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或SEQIDNO:17、逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13-肌动蛋白启动子。


36.根据权利要求34或35所述的分离核酸，其中所述启动子是LP1启动子或mA1MB2-mTTR482启动子。


37.根据权利要求33-36中任一项所述的分离核酸，其中所述核酸还包含多腺苷酸化信号。


38.根据权利要求37所述的分离核酸，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号或HSVTKpA。


39.根据权利要求33-38中任一项所述的分离核酸，其中所述核酸还包含内含子。


40.根据权利要求39所述的分离核酸，其中所述内含子是鸡β-肌动蛋白(CBA)/兔β-球蛋白杂合内含子。


41.根据权利要求39所述的分离核酸，其中所述内含子是SEQIDNO:15的修饰的鸡β-肌动蛋白(CBA)/兔β-球蛋白杂合内含子。


42.根据权利要求33-41中任一项所述的分离核酸，其中所述核酸还包含一个或多个ITR。


43.根据权利要求33-42中任一项所述的分离核酸，其中所述核酸还包含填充核酸。


44.根据权利要求43所述的分离核酸，其中所述填充核酸被优化以去除ATG序列。


45.根据权利要求44所述的分离核酸，其中所述填充核酸是SEQIDNO:16的A1AT内含子填充序列。


46.一种编码人PAH多肽的分离核酸，其中所述核酸是密码子优化的。


47.根据权利要求46所述的分离核酸，其中所述核酸序列与SEQIDNO:14的核酸序列至少80％相同。


48.根据权利要求46所述的分离核酸，其中所述核酸包含SEQIDNO:14的核酸序列。


49.根据权利要求33所述的分离核酸，其中所述核酸是mRNA。


50.一种组合物，其包含根据权利要求33-49中任一项所述的核酸。


51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。


52.一种载体，其包含根据权利要求33-49中任一项所述的核酸。


53.根据权利要求52所述的载体，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。


54.一种rAAV载体，其包含根据权利要求33-41或43-49中任一项所述的核酸，所述核酸的侧翼是一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。


55.根据权利要求54所述的rAAV载体，其中根据权利要求33-48中任一项所述的核酸的侧翼是两个AAVITR。


56.根据权利要求54或55所述的rAAV载体，其中所述AAVITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。


57.根据权利要求54-56中任一项所述的rAAV载体，其中所述AAVITR是AAV2ITR。


58.根据权利要求57所述的rAAV载体，其中所述rAAV载体从5'到3'包含AAV2ITR、启动子、内含子、编码PAH多肽的核酸、填充核酸、多腺苷酸化信号和AAV2ITR。


59.根据权利要求58所述的rAAV载体，其中所述启动子是m1A1MB2-mTTR482启动子或LP1启动子。


60.根据权利要求58或59所述的rAAV载体，其中所述内含子是鸡β-肌动蛋白(CBA)/兔β-球蛋白杂合内含子。


61.根据权利要求58-59中任一项所述的rAAV载体，其中所述PAH多肽是根据权利要求1-30中任一项所述的变体PAH多肽。


62.根据权利要求58-60中任一项所述的rAAV载体，其中编码所述PAH多肽的所述核酸是根据权利要求46-48中任一项所述的密码子优化的核酸。


63.根据权利要求58-62中任一项所述的rAAV载体，其中所述填充核酸包含来自人α1抗胰蛋白酶基因内含子的核酸。


64.根据权利要求63所述的rAAV载体，其中所述人α1抗胰蛋白酶基因的内含子已经突变以去除ATG序列。


65.根据权利要求58-64中任一项所述的rAAV载体，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。


66.根据权利要求53-65中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体是自身互补的载体。


67.根据权利要求66所述的rAAV载体，其中所述载体包含编码所述PAH多肽的第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·库斯迪奥穆尔，P·马纳瓦兰，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：美国;US