由多个寡核苷酸构成的通过与靶标的互补相互作用调控基因表达的多靶向核酸构建体制造技术

本发明专利技术提供一种多靶向核酸构建体，其包含至少：(a)第一核酸部分，其与从靶基因转录的RNA的至少第一部分至少部分地互补；(b)第二核酸部分，其与从靶基因转录的RNA的至少第二部分至少部分地互补，所述靶基因可以与(a)中定义的所述靶基因相同或不同；(c)第三核酸部分，其与(a)的所述第一核酸部分至少部分地互补，从而与所述第一核酸部分形成第一核酸双链体区域；(d)第四核酸部分，其与(b)的所述第二核酸部分至少部分地互补，从而与所述第二核酸部分形成第二核酸双链体区域。所述构建体被设计成使得在体内施用后，所述构建体分解以得到至少第一和第二离散型核酸靶向分子，这些分子分别靶向从(a)和(b)的所述靶基因转录的RNA。通常，所述第一核酸靶向分子能够调节(a)的所述靶基因的表达，并且包含或衍生自(a)的至少所述第一核酸部分。通常，所述第二核酸靶向分子能够调节(b)的所述靶基因的表达，并且包含或衍生自(b)的所述第二核酸部分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由多个寡核苷酸构成的通过与靶标的互补相互作用调控基因表达的多靶向核酸构建体本专利技术属于纳米技术和/或调节的
，该调节为真核生物中基因表达的下调或上调。真核生物中基因表达的此种调节使用通常以纳米结构组装的根据本专利技术的互补寡核苷酸。更具体地，本专利技术属于真核生物中基因表达的调节的
，该调节使用以纳米结构组装的互补寡核苷酸，以研究基因功能、治疗疾病和/或用于其它应用，包括但不限于化妆品和/或农业。本专利技术利用寡核苷酸的结构灵活性以形成纳米结构，并且利用反义寡核苷酸(ASO)和RNA干扰(RNAi)分子(在此组合为互补寡核苷酸(在本文件中用作“CON(对照)”))的能力以调节基因表达。因此，本专利技术整合了属于两个
(纳米技术和CON技术)的组分和知识。根据美国政府赞助的“国家纳米技术计划(NationalNanotechnologyInitiative)”的当前定义，“纳米技术是指在纳米尺度上对尺寸大约在1至100nm之间的物质的理解和控制，其中独特的现象可以实现新颖的应用”[http://nano.gov]。纳米技术涉及多种学科的研究，包括有机化学、材料学、半导体物理学、分子生物学、工程学和其它学科，其愿景是创建可用于电子、IT、医药、能源和日常生活等众多应用的新型纳米材料和分子装置。CON技术融合了人工创建的基于寡核苷酸的分子的能力，该分子通过互补相互作用与生物寡核苷酸靶标相互作用并改变其特性。在其最广泛使用的应用中，CON分子被设计成细胞内结合并灭活蛋白质编码(即，mRNA)或非编码(例如，miRNA、IncRNA)分子，通常导致对应基因的沉默。解读沉默结果可以允许理解基因的功能，因此其用于功能基因组学。在动物(包括人类)中用CON分子下调恶性型基因或上调缺陷型基因也可以允许开发新的治疗性药物。CON分子也有希望应用于其它领域，包括化妆品、生物生产、农业生物和日常生活。作为研究工具，CON分子已得到广泛多样的应用，并且除用作小分子和生物制剂之外，还具备成为第三种主要治疗模式的强大潜力。实际上，世界各地数以千计的研究与开发实验室常规使用基于RNAi的试剂来研究真核生物中的基因功能，并且正在寻找它们作为基因表达调节候选药物用于临床试验的方式。基于ASO的技术(尤其是作为治疗剂)已经探索了较长时间，并且第一种潜在商业上可行的药物(米泊美生，伊希斯制药公司(Mipomersen，IsisPharmaceuticals))最近已经在美国获批上市。第一种RNAi药物Patisiran已于2018年获FDA批准。尽管这些成功显著并且令人印象深刻，但CON技术仍有很大的改进空间。实际上，常规RNAi试剂可能会显示出以下缺陷中的一种或多种：1)繁琐的合成工艺和相对高的制造成本(在RNAi的情况下，例如，需要制备和退火两种寡核苷酸，而只有一种用作活性剂)；2)对各种内切和外切核酸酶的高敏感性，并且因此在任何生物流体中的低稳定性；3)次优的命中率和功效(即使使用当前改进的算法，也不能保证单个分子将产生有效的靶标敲除)；4)非特异性活性和副作用(在RNAi的情况下，源于过客链、miRNA相关联的活性，并且在RNAi和ASO二者的情况下，起源于特定的化学过程和序列)；5)在细胞培养中、特别是在体内递送困难。本专利技术提供了新颖的组合物和方法，其包括特别设计的、由多个寡核苷酸构成的自组装纳米结构，并且能够通过与靶标的互补相互作用调节基因表达。本专利技术提出了解决并克服与互补寡核苷酸技术(例如，反义和RNAi技术)相关联的缺点，如高生产成本、次优的功效和特异性、分子在生物流体中和细胞内的低稳定性、以及在细胞培养中和在体内递送的困难。因此，根据本专利技术，提供了一种核酸构建体，其包含至少：(a)第一核酸部分，其与从靶基因转录的RNA的至少第一部分至少部分地互补；(b)第二核酸部分，其与从靶基因转录的RNA的至少第二部分至少部分地互补，所述靶基因可以与(a)中定义的靶基因相同或不同；(c)第三核酸部分，其与(a)的第一核酸部分至少部分地互补，从而与该第一核酸部分形成第一核酸双链体区域；(d)第四核酸部分，其与(b)的第二核酸部分至少部分地互补，从而与该第二核酸部分形成第二核酸双链体区域；其中构建体被设计成使得在体内施用后，构建体分解以得到至少第一和第二离散型核酸靶向分子，这些分子分别靶向从(a)和(b)的靶基因转录的RNA部分。由此(i)第一核酸靶向分子能够调节(a)的靶基因的表达，并且包含或衍生自(a)的至少第一核酸部分，并且(ii)第二核酸靶向分子能够调节(b)的靶基因的表达，并且包含或衍生自(b)的第二核酸部分。在第一实施例中，根据本专利技术的构建体被设计成分解，使得第一和第二离散型核酸靶向分子分别由独立的、RNAi诱导的沉默复合物加工。在第二实施例中，根据本专利技术的构建体进一步包含不稳定的官能团，使得在体内施用后，该构建体被切割，从而得到至少第一和第二离散型核酸靶向分子。通常，不稳定的官能团包含一个或多个未经修饰的核苷酸，其可以表示构建体内的一个或多个切割位置，由此，在体内施用后，构建体在一个或多个切割位置处被切割，从而得到至少第一和第二离散型核酸靶向分子。根据上述第二实施例，切割位置可以分别位于构建体内，使得切割后，第一离散型核酸靶向分子包含或衍生自第一核酸双链体区域，并且第二离散型核酸靶向分子包含或衍生自第二核酸双链体区域。根据本专利技术的构建体的一级结构合适的是，(a)的第一核酸部分直接或间接地连接至(d)的第四核酸部分作为一级结构。当根据本专利技术的此种构建体是双重靶向构建体时，通常(b)的第二核酸部分直接或间接地连接至(c)的第三核酸部分作为一级结构。根据本专利技术的构建体可以是双重靶向的。可替代地，构建体可以靶向从一个或多个靶基因转录的RNA的多于两个的部分，并且在此类情况下，构建体可以进一步包含1至8个额外的核酸部分，其分别与从一个或多个靶基因转录的RNA的额外的1至8个部分至少部分地互补，所述靶基因可以彼此相同或不同、和/或与上文(a)和/或(b)中定义的靶基因相同或不同，并且其中1至8个额外的核酸部分中的每一个分别与分别与之至少部分地互补的各别的过客核酸部分形成额外的双链体区域。在此类构建体中，(b)的第二核酸部分和1至8个额外的核酸部分直接或间接地连接至所选的过客核酸部分作为各自的一级结构。如上文所述，在根据本专利技术的构建体的各个位置之间可能存在直接或间接的连接。此种直接或间接的连接各自表示(i)核苷间缺口，(ii)核苷间键合，或(iii)1至10个核苷酸的核酸接头部分，其中在(i)的情况下，在(a)的第一核酸部分与(b)的第二核酸部分、或(c)的第三核酸部分与(d)的第四核酸部分之间存在一些互补性。根据本专利技术的构建体可由以下示意性结构表示：其中G1表示(a)的第一核酸部分；G2表示(b)的第二核酸部分；P1表示(c)的第三核酸部分；P2表示(d)的第四核酸部分；G表示分别与从一个或多个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸构建体，包含至少：/n(a)第一核酸部分，其与从靶基因转录的RNA的至少第一部分至少部分地互补；/n(b)第二核酸部分，其与从靶基因转录的RNA的至少第二部分至少部分地互补，所述靶基因可以与(a)中定义的所述靶基因相同或不同；/n(c)第三核酸部分，其与(a)的所述第一核酸部分至少部分地互补，从而与所述第一核酸部分形成第一核酸双链体区域；/n(d)第四核酸部分，其与(b)的所述第二核酸部分至少部分地互补，从而与所述第二核酸部分形成第二核酸双链体区域；/n其中所述构建体被设计成使得在体内施用后，所述构建体分解以得到至少第一和第二离散型核酸靶向分子，这些分子分别靶向从(a)和(b)的所述靶基因转录的所述RNA部分。/n由此(i)所述第一核酸靶向分子能够调节(a)的所述靶基因的表达，并且包含或衍生自(a)的至少所述第一核酸部分，并且(ii)所述第二核酸靶向分子能够调节(b)的所述靶基因的表达，并且包含或衍生自(b)的所述第二核酸部分。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180928 US 62/738,2221.一种核酸构建体，包含至少：
(a)第一核酸部分，其与从靶基因转录的RNA的至少第一部分至少部分地互补；
(b)第二核酸部分，其与从靶基因转录的RNA的至少第二部分至少部分地互补，所述靶基因可以与(a)中定义的所述靶基因相同或不同；
(c)第三核酸部分，其与(a)的所述第一核酸部分至少部分地互补，从而与所述第一核酸部分形成第一核酸双链体区域；
(d)第四核酸部分，其与(b)的所述第二核酸部分至少部分地互补，从而与所述第二核酸部分形成第二核酸双链体区域；
其中所述构建体被设计成使得在体内施用后，所述构建体分解以得到至少第一和第二离散型核酸靶向分子，这些分子分别靶向从(a)和(b)的所述靶基因转录的所述RNA部分。
由此(i)所述第一核酸靶向分子能够调节(a)的所述靶基因的表达，并且包含或衍生自(a)的至少所述第一核酸部分，并且(ii)所述第二核酸靶向分子能够调节(b)的所述靶基因的表达，并且包含或衍生自(b)的所述第二核酸部分。


2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述构建体被设计成分解，使得所述第一和第二离散型核酸靶向分子分别由独立的、RNAi诱导的沉默复合物加工。


3.根据权利要求1所述的构建体，其进一步包含不稳定官能团，使得在体内施用后，所述构建体被切割，从而得到所述至少第一和第二离散型核酸靶向分子。


4.根据权利要求3所述的构建体，其中所述不稳定官能团包含一个或多个未经修饰的核苷酸。


5.根据权利要求4所述的构建体，其中所述不稳定官能团的所述一个或多个未经修饰的核苷酸表示所述构建体内的一个或多个切割位置，由此在体内施用后，所述构建体在所述一个或多个切割位置处被切割，从而得到所述至少第一和第二离散型核酸靶向分子。


6.根据权利要求5所述的构建体，其中所述切割位置分别位于所述构建体内，使得在切割后，所述第一离散型核酸靶向分子包含或衍生自所述第一核酸双链体区域，并且所述第二离散型核酸靶向分子包含或衍生自所述第二核酸双链体区域。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的构建体，其中(a)的所述第一核酸部分直接或间接地连接至(d)的所述第四核酸部分作为一级结构。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的构建体，其是双重靶向构建体，并且其中(b)的所述第二核酸部分直接或间接地连接至(c)的所述第三核酸部分作为一级结构。


9.根据权利要求1至7中任一项所述的构建体，其进一步包含1至8个额外的核酸部分，所述核酸部分分别与从一个或多个靶基因转录的RNA的额外的1至8个部分至少部分地互补，所述靶基因可以彼此相同或不同、和/或与(a)和/或(b)中定义的所述靶基因相同或不同，并且其中1至8个额外的核酸部分中的每一个分别与分别与之至少部分地互补的各别的过客核酸部分形成额外的双链体区域。


10.根据权利要求9所述的构建体，其中(b)的所述第二核酸部分和所述1至8个额外的核酸部分直接或间接地连接至所选的过客核酸部分作为各自的一级结构。


11.根据权利要求7、8或10中任一项所述的构建体，其中所述直接或间接连接各自表示(i)核苷间缺口，(ii)核苷间键合，或(iii)1至10个核苷酸的核酸接头部分，其中在(i)的情况下，在(a)的所述第一核酸部分与(b)的所述第二核酸部分、或(c)的所述第三核酸部分与(d)的所述第四核酸部分之间存在一些互补性。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的构建体，由以下示意性结构表示：



其中
G1表示(a)的所述第一核酸部分；
G2表示(b)的所述第二核酸部分；
P1表示(c)的所述第三核酸部分；
P2表示(d)的所述第四核酸部分；
G表示分别与从一个或多个靶基因转录的RNA的额外的1至8个部分至少部分地互补的所述1至8个额外的核酸部分；
P表示分别与所述1至8个额外的核酸部分至少部分地互补并与其形成所述双链体区域的所述过客核酸部分；
G1、G2、P1、P2中的每一个各自可以分别包括相同或不同数目的核苷酸；
n是选自0至8之间的整数；
其中存在一个或多个相邻和/或不相邻的切割位置，其至少允许从P2分解至少G1、和/或从P1分解至少G2，并且当n为1至8时，还存在一个或多个相邻和/或不相邻的切割位置，其允许从相邻的P分解至少G2、和/或从相邻的G分解至少P1；
x、y、z中的每一个各自表示(i)核苷间缺口，(ii)核苷间键合，或(iii)1至10个核苷酸的核酸接头部分；
其中当n为0，且x、y、z分别表示G1与P2、以及P1与G2之间的核苷间缺口时，则在G1与G2、或P1与P2之间存在一些互补性。


13.根据权利要求11或12所述的构建体，其中所述核酸接头部分是单链的。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的构建体，其进一步包含一个或多个配体，所述一个或多个配体通常偶联至(c)的所述第三核酸部分、和/或(d)的所述第四核酸部分、和/或如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分。


15.根据权利要求14所述的构建体，其中(a)的所述第一核酸部分、和/或(b)的所述第二核酸部分、和/或(c)的所述第三核酸部分、和/或(d)的所述第四核酸部分、和/或如权利要求9、10或12中所定义的所述1至8个额外的核酸部分、和/或如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分分别具有5'至3'方向性，从而定义其5'和3'区域，并且其中所述一个或多个配体偶联在(i)(c)的所述第三核酸部分、和/或(ii)(d)的所述第四核酸部分、和/或(iii)如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分中任一个的所述3'区域处。


16.根据权利要求14所述的构建体，其中(c)的所述第三核酸部分、和/或(d)的所述第四核酸部分、和/或如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分分别具有5'至3'方向性，从而定义其5'区域和3'区域，并且其中所述一个或多个配体偶联在其5'和3'区域中间的一个或多个区域处。


17.根据权利要求14至16中任一项所述的构建体，其中所述一个或多个配体是结合细胞膜或细胞表面上特定靶标的任何细胞定向部分，如脂质、碳水化合物、适配体、维生素和/或肽。


18.根据权利要求17所述的构建体，其中所述一个或多个配体包含一个或多个碳水化合物。


19.根据权利要求18所述的构建体，其中所述一个或多个碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。


20.根据权利要求19所述的构建体，其中所述一个或多个碳水化合物包含一个或多个半乳糖部分、一个或多个乳糖部分、一个或多个N-乙酰基-半乳糖胺部分、和/或一个或多个甘露糖部分。


21.根据权利要求20所述的构建体，其中所述一个或多个碳水化合物包含一个或多个N-乙酰基-半乳糖胺部分。


22.根据权利要求21所述的构建体，其包含两个或三个N-乙酰基-半乳糖胺部分。


23.根据权利要求14至22中任一项所述的构建体，其中所述一个或多个配体以线性构型或支化构型附接。


24.根据权利要求23所述的构建体，其中所述一个或多个配体被附接为双触角构型或三触角构型、或基于不同位置处的单一配体的构型。


25.根据权利要求1至24中任一项所述的构建体，其中(a)的所述第一核酸部分、和/或(b)的所述第二核酸部分、和/或(c)的所述第三核酸部分、和/或(d)的所述第四核酸部分的长度分别为7至20个核苷酸、优选10至18个核苷酸、更优选约15个核苷酸。


26.根据权利要求11至13中任一项所述的构建体，其中所述核酸接头部分的长度为1至8个核苷酸、优选2至6个核苷酸、更优选约4个核苷酸。


27.根据权利要求1至26中任一项所述的构建体，其进一步包含一个或多个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间键。


28.根据权利要求27所述的构建体，其包含1至15个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间键。


29.根据权利要求27或28所述的构建体，其包含(a)的所述第一核酸部分、和/或(b)的所述第二核酸部分、和/或(c)的所述第三核酸部分、和/或(d)的所述第四核酸部分、和/或如权利要求9、10或12中所定义的所述1至8个额外的核酸部分、和/或如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分的5'和/或3'区域中的一个或多个处的一个或多个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间键。


30.根据权利要求27至29中任一项所述的构建体，其包含如权利要求11至13中所定义的所述核酸接头部分的至少两个相邻核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间键。


31.根据权利要求30所述的构建体，其包含存在于所述核酸接头部分中的每个相邻核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间键。


32.根据权利要求27至31中任一项所述的构建体，其包含连接以下的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷酸间键：
(a)的所述第一核酸部分至如权利要求11至13中所定义的所述核酸接头部分；和/或
(b)的所述第二核酸部分至如权利要求11至13中所定义的所述核酸接头部分；和/或
(c)的所述第三核酸部分至如权利要求11至13中所定义的所述核酸接头部分；和/或
(d)的所述第四核酸部分至如权利要求11至13中所定义的所述核酸接头部分；和/或
如权利要求9、10或12中所定义的所述1至8个额外的核酸部分至如权利要求11至13中所定义的所述核酸接头部分；和/或
如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分至如权利要求11至13中所定义的所述核酸接头部分。


33.根据权利要求1至32中任一项所述的构建体，其中对以下中的至少一个的至少一个核苷酸进行修饰：
(a)的所述第一核酸部分；和/或
(b)的所述第二核酸部分；和/或
(c)的所述第三核酸部分；和/或
(d)的所述第四核酸部分；和/或
如权利要求9、10或12中所定义的所述1至8个额外的核酸部分；和/或
如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分；和/或
如权利要求11至13中所定义的所述核酸接头部分。


34.根据权利要求33所述的构建体，其中对从以下中的一个的5'区域开始的奇数编号核苷酸中的一个或多个进行修饰、和/或其中对从以下中的一个的5'区域开始的偶数编号核苷酸中的一个或多个进行修饰，其中通常对偶数编号核苷酸的修饰是不同于对奇数编号核苷酸的修饰的第二修饰：
(a)的所述第一核酸部分；和/或
(b)的所述第二核酸部分；和/或
(c)的所述第三核酸部分；和/或
(d)的所述第四核酸部分；和/或
如权利要求9、10或12中所定义的所述1至8个额外的核酸部分；和/或
如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分。


35.根据权利要求33或34所述的构建体，其中从(c)的所述第三核酸部分的3'区域开始的奇数编号核苷酸中的一个或多个通过不同于对从(a)的所述第一核酸部分的5'区域开始的奇数编号核苷酸的修饰的修饰来修饰；和/或
其中从(d)的所述第四核酸部分的3'区域开始的奇数编号核苷酸中的一个或多个通过不同于对从(b)的所述第二核酸部分的5'区域开始的奇数编号核苷酸的修饰的修饰来修饰；和/或
其中从如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分的3'区域开始的奇数编号核苷酸中的一个或多个通过不同于对从如权利要求9、10或12中所定义的所述1至8个额外的核酸部分的5'区域开始的奇数编号核苷酸的修饰的修饰来修饰；和/或
其中如权利要求11至13中所定义的核酸接头部分的核苷酸中的一个或多个通过(i)不同于对(a)的所述第一核酸部分的3'区域的相邻核苷酸的修饰；和/或(ii)不同于对(b)的所述第二核酸部分的3'区域的相邻核苷酸的修饰；和/或不同于对从如权利要求9、10或12中所定义的所述1至8个额外的核酸部分的3'区域的相邻核苷酸的修饰的修饰来修饰。


36.根据权利要求33至35中任一项所述的构建体，其中从i(c)的所述第三核酸部分、和/或(ii)(d)的所述第四核酸部分、和/或(iii)如权利要求9、10或12中所定义的所述过客核酸部分的3'区域开始的偶数编号核苷酸中的一个或多个通过不同于对从这些相应部分的3'区域开始的奇数编号核苷酸的修饰的修饰来修饰。


37.根据权利要求33至36中任一项所述的构建体，其中(i)(a)的所述第一核酸部分、和/或(ii)(b)的所述第二核酸部分、和/或(iii)如权利要求9、10或12中所定义的所述1至8个额外的核酸部分的经修...

【专利技术属性】
技术研发人员：D萨马尔斯基，
申请(专利权)人：圣诺制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US