一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种一步法、快速、高灵敏度的巢式重组酶‑聚合酶扩增的方法、以及核酸快速检测的方法、用于巢式重组酶‑聚合酶扩增方法的试剂盒。相比于传统巢式RPA的两步法反应，本发明专利技术通过引入特殊的修饰方法，将两对引物同时加入到反应体系中，一步完成核酸的快速扩增和/或检测。同时，本发明专利技术配合470nm单色LED灯以及滤光片可以通过裸眼判断检测结果，全程无需打开反应管。

【技术实现步骤摘要】
一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种一步法、快速、高灵敏度的巢式重组酶-聚合酶扩增的方法、以及核酸快速检测的方法、用于巢式重组酶-聚合酶扩增方法的试剂盒。
技术介绍
重组酶-聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。最初由ASMscientific,Inc.于2003年申请专利(EP1499738B1)。此类扩增反应又被称为recombinase-aidamplification(RAA)，MultienzymeIsothermalRapidAmplification(MIRA)和体温扩增技术(STAMP)。其基本原理都为重组酶与引物形成组合体(filament)，入侵到底物核酸templatestrand进行，对双链进行打开，结合到引物互补的部位；接着具有strandeddisplacement能力DNA聚合酶作用下，在引物3’端开始合成互补链。Displaced的单链由单链结合蛋白所结合，组装原双链的复合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法，其特征在于，所述的方法包括：/n配制反应体系，加入1)第一引物对，和，2)第二引物对和/或探针；/n进行RPA或RT-RPA反应扩增；/n其中，第二引物对位于所述第一引物对RPA或RT-RPA反应扩增获得的模板内，所述的第二引物对包含/idSp/酶切位点和阻止3’端扩增的修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法，其特征在于，所述的方法包括：
配制反应体系，加入1)第一引物对，和，2)第二引物对和/或探针；
进行RPA或RT-RPA反应扩增；
其中，第二引物对位于所述第一引物对RPA或RT-RPA反应扩增获得的模板内，所述的第二引物对包含/idSp/酶切位点和阻止3’端扩增的修饰。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阻止3’端扩增的修饰选自羟甲基叠氮、C18、C12、ddNTP、RNA、PNA或C3spacer。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的1)第一引物对，和，2)第二引物对和/或探针，为一步加入。


4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的RPA或RT-RPA反应中添加能够识别/idSp/的核酸内切酶，所述的核酸内切酶优选为Exo或nfo。


5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的第二引物对和/或探针还包含荧光报告基团和荧光淬灭基团的修饰，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、Cy3或TAMRA，所述的荧光淬灭基团选自DABCYL、BHQ1、BHQ2或BHQ3、Eclipse、MGB。


6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的第二引物对和/或探针中的/idSp/被nfo或exo切割后，产生可以扩增的3’OH末端，继续进行扩增反应。


7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的第二引物对与所述第一引物对不重叠或小于10bp的重叠。


8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的RPA或RT-RPA反应分别可用于DNA或RNA的扩增。


9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述的RPA或RT-RPA反应时间为5-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：白净卫，刘册，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11