一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用，包括Takin‑F和Takin‑R，具体序列为：Takin‑F：5’‑TTCTGCGATTCTGCTTCGTG‑3’；Takin‑R：5’‑CCAGACCCGATGAACACCAG‑3’。对羚牛肌肉组织总RNA的进行转录组测序，根据转录组测序的结果找出了不保守cDNA序列，利用相关生物学分析工具确定了目标cDNA序列，针对此目标cDNA序列设计了特异性引物Takin‑F和Takin‑R，利用特异性引物Takin‑F和Takin‑R鉴定羚牛肌肉组织的提高了鉴定速度和鉴定结果的可靠性；本发明专利技术的引物Takin‑F和Takin‑R用于鉴定羚牛肌肉组织特异性时采取荧光定量PCR法，提高了鉴定的灵敏性、特异性和精确性，同时提高了鉴定速度，鉴定结果的观测重复性好、直观性好且可靠性高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用
本专利技术属于动物分子生物学
，涉及羚牛防盗猎鉴定，具体涉及一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用。
技术介绍
羚牛(Budorcastaxicolor)为我国的一级保护动物，栖息于高海拔、高寒悬崖地段，体形较大，往往成为非法盗猎的目标，森林公安在缴获盗猎羚牛酮体时，依赖传统分类形态特征无法将其与牛、羊等区分，存在较大的局限性，依赖传统分类形态特征鉴定羚牛不仅费时费力，而且常受主观因素干扰，极易混淆出错，除此之外，传统的鉴定方法难以开展针对残缺个体的鉴别。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于，提供一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物及其应用，解决现有技术中羚牛防盗猎鉴定费时费力的技术问题。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案予以实现：一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物，包括Takin-F和Takin-R，具体序列为：Takin-F：5’-TTCTGCGATTCTGCTTCGTG-3’；Takin-R：5’-CCAGACCCGATGAACACCAG-3’。本专利技术还保护一种如上所述的用于羚牛防盗猎鉴定的引物用于羚牛防盗猎鉴定的应用。具体的，该应用为采用荧光定量PCR法，将Takin-F和Takin-R作为荧光定量PCR扩增的引物，进行羚牛防盗猎鉴定。具体的，荧光定量PCR法具体包括如下步骤：步骤一，提取并保存羚牛肌肉组织总RNA；步骤二，反转录PCR扩增：取出步骤一中所述的羚牛肌肉组织总RNA，将羚牛肌肉组织总RNA去除基因组DNA后作为反转录PCR扩增的RNA模板，混合反转录PCR反应液，设定反转录PCR反应程序，进行反转录PCR扩增，得到cDNA混合液；步骤三，荧光定量PCR扩增：将步骤二中的cDNA混合液用水稀释后，即得到荧光定量PCR扩增的cDNA模板，分别制备实验组荧光定量PCR反应液和内参组荧光定量PCR反应液，制备好的实验组荧光定量PCR反应液和内参组荧光定量PCR反应液后，设定荧光定量PCR反应程序，进行荧光定量PCR扩增，获得相应的数据；步骤四，将步骤三中获得的数据进行处理和结果分析。具体的，步骤一中，所述的提取羚牛肌肉组织总RNA的具体方法包括如下步骤：步骤1.1，取出保存在-80℃的羚牛肌肉组织，加入1mL的Trizol裂解液和两个钢珠后，剧烈震荡，使羚牛肌肉组织在Trizol裂解液中充分裂解，得到混合液A；步骤1.2，在步骤1.1中所述的混合液A中加入0.2mL氯仿，剧烈震荡30s后，室温孵育3min，得到混合液B；步骤1.3，将步骤1.2中所述的混合液B在4℃，1200r/min的条件下离心15min，得到分层的混合液C，混合液C的上层清液中包含羚牛肌肉组织总RNA，中间层包含羚牛肌肉组织蛋白质，最下层包含氯仿；步骤1.4，将步骤1.3中所述的混合液C中的上层清液转移至1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，得到混合液D；步骤1.5，将步骤1.4中所述的混合液D在4℃，1200r/min的条件下离心10min，离心完成后，离心管中为上清E和沉淀F；步骤1.6，将步骤1.5中所述的上清E弃去，沿离心管壁缓慢加入1mL75％的预冷过的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀F，将上述包含沉淀F的预冷过的乙醇在4℃，12000rpm的条件下离心5min，离心完成后，离心管中为上清G和沉淀H；步骤1.7，将步骤1.6中所述的上清G弃去，室温干燥沉淀H2～5min后，加入适量水使溶解沉淀H，沉淀H完全溶解后即得到羚牛肌肉组织总RNA，测定羚牛肌肉组织总RNA的浓度后，-80℃保存备用。具体的，步骤二中，所述的反转录PCR反应液由以下组分混合而成：RNA模板为10μL、反转录缓冲液为4μL、反转录酶液为1μL、通用RT引物为1μL、水4μL，各组分体积之和为20μL；步骤二中，所述的反转录PCR反应程序具体为，37℃反应15min后，再85℃反应5s。具体的，步骤三中，所述的实验组荧光定量PCR反应液由以下组分混合而成：cDNA模板为2μL、Takin-F为0.6μL、Takin-R为0.6μL、荧光PCR预混试剂为10μL、水6.8μL，各组分体积之和为20μL；步骤三中，所述的内参组荧光定量PCR反应液由以下组分混合而成：cDNA模板为2μL、18sPF为0.6μL、18sPR为0.6μL、荧光PCR预混试剂为10μL、水6.8μL，各组分体积之和为20μL；步骤三中，所述的荧光定量PCR反应程序具体为，95℃预变性30s，循环数为40，每个循环95℃变性10s，60℃退火延伸20s，40个循环结束后，70℃延伸10min。本专利技术与现有技术相比，具有如下技术效果：(Ⅰ)本专利技术对羚牛肌肉组织总RNA的进行转录组测序，根据转录组测序的结果找出了不保守cDNA序列，利用相关生物学分析工具确定了目标cDNA序列，针对此目标cDNA序列设计了特异性引物Takin-F和Takin-R，利用特异性引物Takin-F和Takin-R鉴定羚牛肌肉组织，提高了鉴定速度和鉴定结果的可靠性。(Ⅱ)本专利技术的引物Takin-F和Takin-R用于羚牛防盗猎鉴定时采取荧光定量PCR法，提高了鉴定的灵敏性、特异性和精确性，同时提高了羚牛防盗猎鉴定的鉴定速度，鉴定结果的观测重复性好、直观性好且可靠性高。以下结合实施例对本专利技术的具体内容作进一步详细解释说明。附图说明图1为本专利技术实施例1和对比例1荧光定量PCR显著性差异的柱状图。图2为本专利技术实施例1和对比例2荧光定量PCR显著性差异的柱状图。图3为本专利技术实施例1和对比例3荧光定量PCR显著性差异的柱状图。图4本专利技术实施例1和对比例4荧光定量PCR显著性差异的柱状图。图5本专利技术实施例1和对比例5荧光定量PCR显著性差异的柱状图。图中符号表示的含义：图1至图5中，代表cDNA模板的来源物种为羚牛；图1至图5中，分别代表cDNA模板的来源物种为秦川牛、绵羊、山羊、鸡和猪；“*”表示当P值<0.05时，图中两组数据之间具有显著性差异，“*”的数目越多代表显著性差异越大。具体实施方式本专利技术对羚牛肌肉进行无参转录组测序，根据比对结果筛选出在羚牛与牛、羊、猪、鸡等不保守的转录组序列，通过设计特异性的定量引物，运用相对定量检测其在羚牛、牛、羊、猪、鸡肌肉组织cDNA中相对表达量，得到一对可用于鉴定羚牛肌肉组织的引物Takin-F和Takin-R，能够快速准确鉴定出羚牛肌肉组织。需要说明的是，本申请中：羚牛(Budorcastaxicolor)、秦川牛(Bostaurus)、绵羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)、鸡(Gallusgallus)和猪(Susscrofa)的肌肉组织均为本申本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物，其特征在于，包括Takin-F和Takin-R，具体序列为：/nTakin-F：5’-TTCTGCGATTCTGCTTCGTG-3’；/nTakin-R：5’-CCAGACCCGATGAACACCAG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于羚牛防盗猎鉴定的引物，其特征在于，包括Takin-F和Takin-R，具体序列为：
Takin-F：5’-TTCTGCGATTCTGCTTCGTG-3’；
Takin-R：5’-CCAGACCCGATGAACACCAG-3’。

【专利技术属性】
技术研发人员：李安宁，郭睿，李一丹，昝林森，马征，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61