一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法技术

本发明专利技术公开了一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法。该方法通过n轮脱氧核糖核酸聚合酶链式反应后扩增得到的目标分子数计算公式

【技术实现步骤摘要】
一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法
本专利技术涉及生物学领域，尤其是分子生态学和分子生物学中评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法。
技术介绍
聚合酶链式反应被广泛应用于脱氧核糖核酸分子的体外扩增，以获取大量序列相同的脱氧核糖核酸分子。采用通用引物对生物群落中的目标分子进行聚合酶链式反应扩增后再采用高通量测序技术对得到的扩增片段进行测序分析成为当前分析生物群落中目标分子以及它们对应的物种或基因组成信息的重要技术手段，尤其是针对核糖体小亚基RNA基因（即原核生物的16SrRNA基因和真核生物的18SrRNA基因）、真核生物的ITS序列、氨单加氧酶amoA基因等目标分子的测序研究，已广泛应用于土壤、水体、底泥、肠道、热泉等多个生态系统群落物种和功能基因组成研究。然而，由于引物匹配性差异、各种拟扩增的目标分子序列差异以及这些序列的内部结构差异等因素的影响，导致在进行聚合酶链式反应时，生物群落中不同的目标分子的扩增效率可能存在差异，从而影响到这些目标分子经过聚合酶链式反应后得到的扩增片段的数量比例与扩增之前的数量比例存在差异，进而影响到对所分析的生物群落中目标分子以及它们对应的物种或功能基因组成比例分析的准确性。但是，目前为止尚没有一种有效评估生物群落中各种目标分子聚合酶链式反应扩增效率差异的技术或方法。
技术实现思路
本专利技术要解决如何评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的问题，利用本专利技术提供的实验和计算方法，能够有效评估群落中各研究对象的脱氧核糖核酸分子在进行聚合酶链式反应时的扩增效率差异，并能够通过数据换算排除因聚合酶链式反应扩增效率差异对研究群落中各研究对象相对比例的计算造成的影响。本专利技术基于进行n轮脱氧核糖核酸聚合酶链式反应后扩增得到的目标分子数的计算公式1：（公式1）其中为进行n轮脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应后研究对象a扩增得到的目标分子数量，为群落中研究对象a的核酸扩增效率，为聚合酶链式反应开始时研究对象a的目标脱氧核糖核酸分子数量。对公式（1）两边进行对数处理，得到公式2：（公式2）同理，对于群落中的研究对象b，也有：（公式3）其中为进行n轮脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应后研究对象b扩增得到的目标分子数量，为群落中研究对象b的核酸扩增效率，为聚合酶链式反应开始时研究对象b的目标脱氧核糖核酸分子数量。将公式2跟公式3相减，得到：（公式4）进行如下格式转换：得到：（公式5）设0<<，且,∈N*，根据公式5则有：即：（公式6）其中为轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量。对公式6进行格式转换，得到：即：（公式7）由公式7可以看出，研究对象a和研究对象b的目标分子的聚合酶链式反应扩增效率仅与经过和轮脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应后研究对象a和研究对象b扩增得到的目标分子数量的比值以及和的差值有关，其中和轮脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应后研究对象a和研究对象b扩增得到的目标分子数量的比值可以通过高通量测序得到，和的差值已知，因此可以计算得到研究对象a和研究对象b的目标分子的聚合酶链式反应扩增效率的差异。利用本专利技术开展群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异评估的技术流程为：首先提取生物群落总DNA并采用目标分子通用引物对群落总DNA进行不同循环次数的聚合酶链式反应扩增得到目标分子脱氧核糖核酸片段，同一个生物群落至少要进行两次不同循环次数的聚合酶链式反应；而后对扩增得到的目标分子脱氧核糖核酸片段进行高通量测序分析，得到不同循环次数的聚合酶链式反应扩增获得的群落中的脱氧核糖核酸序列组成及相对比例信息；最后通过公式7计算得到（图1）。附图说明图1本专利技术的技术流程图。其中DNA为脱氧核糖核酸，PCR即聚合酶链式反应；0<<<，且,,∈N*；为群落中研究对象a的脱氧核糖核酸聚合酶链式反应扩增效率；为群落中研究对象b的脱氧核糖核酸聚合酶链式反应扩增效率；为轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量。图2本专利技术的技术流程图。图3实施例1中分析的硝化螺旋菌（Nitrospira）与红游动菌（Rhodoplanes）、浮霉菌（Planctomyces）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、假单胞菌（Pseudomonas）、黄杆菌（Flavobacterium）、地杆菌（Geobacter）、红长命菌（Rubrivivax）、沙壤土杆菌（Ramlibacter）和土微菌（Pedomicrobium）的16SrRNA基因聚合酶链式反应扩增效率差异情况。具体实施方式以下实施是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术技术参数的限制。实施例1采用本专利技术描述的方法，对广东省东莞市松山湖园区2个采样地区采集的6个森林土壤样品细菌群落的核糖体小亚基RNA基因（即16SrRNA基因）分别进行了25个循环、28个循环和30个循环的聚合酶链式反应扩增，得到的扩增片段采用HiSeq高通量测序仪进行PE250测序后采用QIIME1.9.0软件对测序数据进行分析，每个样品随机抽取16056条序列进行分析，得到每个样品的可操作分类单位（OTU）组成（可看作是物种组成）信息，而后采用本专利技术中描述的公式7对群落测序数据中硝化螺旋菌（Nitrospira）与红游动菌（Rhodoplanes）、浮霉菌（Planctomyces）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、假单胞菌（Pseudomonas）、黄杆菌（Flavobacterium）、地杆菌（Geobacter）、红长命菌（Rubrivivax）、沙壤土杆菌（Ramlibacter）和土微菌（Pedomicrobium）的16SrRNA基因聚合酶链式反应扩增效率差异情况，结果如图2所示，在多数情况下，各物种与硝化螺旋菌的比值都在1附近，说明它们的扩增效率基本一致；但也存在该比值远远偏离1的情况，这种情况并不是因为扩增效率差异造成的，而是因为该细菌在群落中的相对丰度较低，高通量测序时存在随机测序造成的随机误差。另外，利用我们提供的评估方法还发现，各细菌与硝化螺旋菌的比值并没有展现出都大于1（表示扩增效率大于硝化螺旋菌）或者都小于1（表示扩增效率小于硝化螺旋菌）的情况，表明不同的聚合酶链式反应中，各物种的扩增效率存在随机性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法，其特征在于：根据公式

【技术特征摘要】
1.一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法，其特征在于：根据公式（其中0<<，且,∈N*；为群落中研究对象a的脱氧核糖核酸聚合酶链式反应扩增效率；为群落中研究对象b的脱氧核糖核酸聚合酶链式反应扩增效率；为轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；为轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量）和应用高通量测序技术测得的和轮聚合酶链式反应后生物群落中研究对象a和研究对象b的目标分子数量和以及和，能够评估群落中目标脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异。


2.权利要求书1所述的一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法，包括以下步骤：首先采用脱氧核糖核酸目标分子通用引...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪加加，李占景，
申请(专利权)人：广东美立康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44