一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用，包括底物、模板、APE1酶、DNA聚合酶、dNTP/dUTP混合物、UDG酶和荧光染料，底物和模板均为单链DNA，底物含有8‑氧鸟嘌呤，底物的3’端用NH

【技术实现步骤摘要】
一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用
本专利技术属于分析检查
，涉及一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶1(hOGG1)是细胞核和线粒体中一种重要的糖基化酶，作用于与胞嘧啶配对的8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，启动所有生物体中氧化鸟嘌呤碱基的切除修复过程。hOGG1水平的异常与各种疾病有关，因此准确简便的检测hOGG1的活性在疾病的预测和诊断方面具有重要意义。据专利技术人研究了解，近年来，等温指数扩增反应(EXPAR)因其操作简单、反应快、放大效率高而成为一种很有前途的分子诊断技术。在经典的EXPAR实验中，切刻内切酶通常用于循环切割磷酸二酯键，使切刻位点的3’端作为引物不断地启动新一轮复制。然而在EXPAR分析中使用切刻内切酶容易引起不必要的非特异性扩增，这限制了实际应用中检测的可靠性和特异性。另外增加切刻内切酶的数量还会降低EXPAR的反应速率。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用，该检测体系能更简单快速的完成检测；能够进行指数放大反应，提高了hOGG1检测的灵敏度；避免了切刻内切酶的使用，从而有效防止在传统EXPAR系统中观察到的非特异性扩增。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一方面，一种一步法荧光检测体系，包括，底物和模板：底物和模板均为单链DNA，底物含有8-氧鸟嘌呤，底物的3’端用NH2修饰；模板由至少一条DNA1和至少一条DNA2交错连接形成，DNA1与DNA2中均不含腺嘌呤，DNA1与DNA2的连接处含有腺嘌呤脱氧核苷酸；底物与DNA1、一部分DNA2互补，与8-氧鸟嘌呤互补的胞嘧啶位于DNA1；APE1酶：用于切割AP位点；DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物：用于在切除AP位点后3’OH端进行延伸反应，dNTP中不含dTTP；UDG酶：用于清除延伸反应获得延伸产物中的尿嘧啶；荧光染料：用于与扩增产物产生荧光。本专利技术中，底物的3’端用NH2修饰用于防止非特异性扩增。底物含有8-氧鸟嘌呤，且与8-氧鸟嘌呤互补的胞嘧啶位于DNA1，能够使hOGG1在特定位置识别并切除8-氧鸟嘌呤产生AP位点，通过APE1酶切割产生3’OH端，然后通过DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物进行延伸反应，由于连接处的腺嘌呤脱氧核苷酸，使得尿嘧啶核苷酸掺入延伸产物中，再通过UDG酶识别并切除尿嘧啶，然后通过APE1酶切割产生3’OH端，从而进行扩增，通过荧光染料能够检测到扩增产物，从而实现对hOGG1活性的检测。模板中DNA1和DNA2的条数影响扩增重数，例如，当只有一条DNA1和一条DNA2时，只有一个连接处，通过该连接处的腺嘌呤碱基的作用只能进行单重扩增；当存在两条DNA1和一条DNA2时，有两个连接处，即含有2个腺嘌呤碱基，则可以实现三重扩增；而当存在两条DNA1和两条DNA2时，有三个连接处，即含有3个腺嘌呤碱基，则可以实现四重扩增；即DNA1和DNA2的条数影响腺嘌呤碱基的个数，从而影响扩增效率，扩增效率越大，检测效果越好。另一方面，一种DNA糖基化酶活性的检测方法，将含有hOGG1的待测样品加入上述一步法荧光检测体系进行孵育，然后进行荧光检测。第三方面，一种DNA糖基化酶活性的检测试剂盒，包括上述一步法荧光检测体系、缓冲溶液。第四方面，一种上述一步法荧光检测体系在筛选hOGG1抑制剂中的应用。第五方面，一种上述一步法荧光检测体系在制备检测癌细胞试剂中的应用。本专利技术的有益效果为：1.与传统方法耗时、操作步骤多相比，本专利技术提供的一步法荧光检测体系在检测hOGG1活性过程中，只需一步操作，总检测时间约为40min，不需要额外的引物探针和修饰分离步骤，具有较高的选择性和灵敏度，同时还具有零背景的特点。2.本专利技术提供的一步法荧光检测体系在检测hOGG1活性过程中利用hOGG1诱导的8-oxoG碱基的高特异性切除和多重循环酶修复扩增的高扩增效率，以快速、简单的混合-读取方式灵敏地检测hOGG1，检测限为2.97×10-8U/μL。3.本专利技术提供的一步法荧光检测体系还能够用于酶抑制剂的筛选和人癌细胞中hOGG1的检测。由于该一步法荧光检测体系检测的简单性，并且能够提高的检测效率，混合-读取分析是一个很有前途的平台，可以进一步用于开发诊断试剂。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术实施例中采用混合-读取法检测hOGG1的机理图。图2为本专利技术实施例中采用混合-读取法检测hOGG1可行性实验的结果图，(A)聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)电泳对hOGG1酶切反应分析，(B)分别在hOGG1+APE1+UDG(实验)、hOGG1+APE1、hOGG1+UDG和APE1+UDG存在下实时监测反应产物的荧光曲线，(C)聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)电泳对RCA反应产物分析，(D)分别在hOGG1+APE1+UDG(实验)、hOGG1+APE1、hOGG1+UDG和APE1+UDG存在下测定反应产物的荧光光谱。图3为本专利技术实施例中采用其他模板设计检测hOGG1的机理图，(A)模板-2，(B)模板-3。图4为本专利技术实施例中采用其他模板设计检测hOGG1的荧光光谱，(A)模板-1，(B)模板-2，(C)模板-3，(D)三种模板(F-F0)/F0值的比较结果。图5为本专利技术实施例中检测hOGG1的优化实验结果图，(A)不同用量模板-1对应的荧光值变化，(B)不同缓冲液组合的荧光值变化，(C)不同用量APE1酶对应的荧光值变化，(D)不同用量UDG酶对应的荧光值变化，(E)不同用量KF酶对应的荧光值变化，(F)不同浓度dNTP/dUTP对应的荧光值变化，(G)不同反应时间对应的荧光值的变化。图6为本专利技术实施例中检测hOGG1的灵敏度和特异性的检测结果图，(A)随hOGG1浓度变化的荧光光谱曲线，(B)荧光强度随hOGG1浓度变化的曲线，插图显示在1×10-7到5×10-5U/μL范围内荧光强度与hOGG1浓度的对数呈线性相关,(C)对0.02U/μLhOGG1、0.02g/L牛血清白蛋白、0.02g/LIgG、0.02U/μLAAG、0.02U/μLTDG和反应缓冲液(对照)的条件下进行荧光光谱测定。图7为本专利技术实施例中不同浓度O8抑制剂对应的hOGG1相对活性结果图。图8为本专利技术实施例对实际样品检测的结果图，(A)测量A549、HeLa、HL-7702、HEK-293T细胞提取物和热失活A549细胞提取物的荧光强度，(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种一步法荧光检测体系，其特征是，包括，/n底物和模板：底物和模板均为单链DNA，底物含有8-氧鸟嘌呤，底物的3’端用NH

【技术特征摘要】
1.一种一步法荧光检测体系，其特征是，包括，
底物和模板：底物和模板均为单链DNA，底物含有8-氧鸟嘌呤，底物的3’端用NH2修饰；模板由至少一条DNA1和至少一条DNA2交错连接形成，DNA1与DNA2中均不含腺嘌呤，DNA1与DNA2的连接处含有腺嘌呤脱氧核苷酸；底物与DNA1、一部分DNA2互补，与8-氧鸟嘌呤互补的胞嘧啶位于DNA1；
APE1酶：用于切割AP位点；
DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物：用于在切除AP位点后3’OH端进行延伸反应，dNTP中不含dTTP；
UDG酶：用于清除延伸反应获得延伸产物中的尿嘧啶；
荧光染料：用于与扩增产物产生荧光。


2.如权利要求1所述的一步法荧光检测体系，其特征是，模板由两条DNA1和两条DNA2交错连接形成；
优选地，所述底物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述模板的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.如权利要求1所述的一步法荧光检测体系，其特征是，所述DNA聚合酶为Klenow大片段聚合酶；
或，荧光染料为SYBRGreenII。


4.如权利要求1所述的一步法荧光检测体系，其特征是，底物的浓度为10nM时，模板的浓度为14～16nM；
或，底物的量为2×10-4nmol时，APE1酶的用量为0.75～0.85U；
或，底物的量为2×10-4nmol时，UDG酶的用量不低于2U，优选地，UDG酶的用量优选2.0～2.2U；
或，底物的量为2×10...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，胡娟，刘雯，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37