一种增强实时荧光PCR信号的试剂和方法技术

本发明专利技术提供了一种增强荧光PCR信号的试剂及其应用，包括含有甜菜碱和二甲基亚砜的增强剂。在检测待测位点附近GC含量较高的基因时，本发明专利技术提供的试剂和方法可使高GC含量区域内的基因位点分型更有效，具体为Ct值更小，信号值更高，非特异信号更低。

【技术实现步骤摘要】
一种增强实时荧光PCR信号的试剂和方法
本专利技术涉及生物
，更为具体的是涉及用于增强荧光PCR信号的试剂组合物和方法。
技术介绍
实时荧光PCR技术，通过引入特异性探针并实时监测荧光信号以监测PCR产物的扩增。相比于测序法、基因芯片法、等位基因特异性PCR技术、高分辨率熔解曲线法，实时荧光PCR全过程可以在单管内封闭完成，并且可以自动分析结果，具有灵敏度高、分型准确、操作简便快捷的特点，是一种先进的分子检测技术。目前，利用实时荧光PCR法进行基因多态性检测、病毒等微生物病原体检测方面的应用越来越广泛。基因组中广泛存在高GC含量的DNA序列，它们特别容易形成二级结构干扰PCR。使用实时荧光PCR技术进行基因多态性检测，需要针对待测位点进行引物和探针的设计。由于检测原理的特殊性，设计探针时一般使待测位点处于探针3’端三分之一处，扩增产物长度一般控制在70bp-150bp。由于必需围绕待测位点进行设计，因此引物、探针序列的选择空间比较小，当待测位点附近GC含量较高时，一是选择的引物探针序列的GC含量必然较高，二是DNA模板自身易于形成稳定的发夹环二级结构，导致引物探针的非特异结合，进而导致Ct值偏大、荧光信号弱和非特异信号高等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种实时荧光PCR增强剂以克服GC含量高、及由于高GC含量引起的发夹环二级结构等原因引起的Ct值偏大、荧光信号弱和有非特异信号高等问题。为实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：提供一种实时荧光PCR的增强剂，包括甜菜碱和二甲基亚砜；所述甜菜碱、二甲基亚砜浓度比为(4M-4.62M):(7.69v/v％-20％)(体积百分比)。在一些实施方案中，所述增强剂中当甜菜碱浓度为5M，二甲基亚砜浓度为100％时，所述甜菜碱、二甲基亚砜体积比为4:1至12:1。当甜菜碱、二甲基亚砜浓度发生变化时，本领域技术人员根据各组分浓度对各组分比例进行适当调整，都属于本专利技术保护范围。在本专利技术一些实施方案中，所述增强剂由甜菜碱、二甲基亚砜组成。甜菜碱浓度为5M，二甲基亚砜浓度为100％，甜菜碱、二甲基亚砜体积比4:1。所述增强剂添加到荧光PCR反应体系中的终浓度为甜菜碱0.2M，二甲基亚砜1％。在本专利技术一些实施方案中，所述增强剂由甜菜碱、二甲基亚砜组成。甜菜碱浓度为5M，二甲基亚砜浓度为100％，甜菜碱、二甲基亚砜体积比为8:1。所述增强剂添加到实时荧光PCR反应体系中的终浓度为甜菜碱0.6M，二甲基亚砜1.5％。在本专利技术一些实施方案中，所述增强剂由甜菜碱、二甲基亚砜组成。甜菜碱浓度为5M，二甲基亚砜浓度为100％，甜菜碱、二甲基亚砜体积比为12:1。所述增强剂添加到实时荧光PCR反应体系中的终浓度为甜菜碱1.2M，二甲基亚砜2％。一种增强荧光PCR信号的方法，包括配置实时荧光PCR反应体系，在实时荧光PCR反应体系中添加增强剂，所述增强剂包括甜菜碱和二甲基亚砜。在本专利技术一些实施方案中，添加至实时荧光PCR反应体系中的甜菜碱的终浓度为0.2M至1.2M。在本专利技术一些实施方案中，添加至实时荧光PCR反应体系中的二甲基亚砜的终浓度为1％至2％(体积百分比)。本专利技术还提供了一种实时荧光PCR的反应体系，包括Taq酶、dNTP和PCR缓冲液，其特征在于，还包括增强剂，所述增强剂包括甜菜碱和二甲基亚砜。在本专利技术一些实施方案中，添加至实时荧光PCR反应体系中的甜菜碱的终浓度为0.2M至1.2M。在本专利技术一些实施方案中，添加至实时荧光PCR反应体系中的二甲基亚砜的终浓度为1％至2％(体积百分比)。本专利技术所述增强剂中的甜菜碱提高高GC区域DNA小沟中鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响DNA构象，解除二级结构，防止DNA聚合酶的从模板DNA中解离，同时甜菜碱还可降低高Tm值引物的退火温度。所述增强剂中的二甲基亚砜可直接解除模板DNA的二级结构，从而增加引物探针与模板的特异性结合，降低非特异结合。本专利技术可使高GC含量区域内的基因位点分型更有效，具体为Ct值更小，信号值更高，非特异信号更低。附图说明图1示实施例2的实时荧光PCR结果。图2示实施例3的实时荧光PCR结果。具体实施方式为了使本专利技术的技术方法、优势及目的更加清晰易懂，下面结合具体实施例及相关附图，对本专利技术进行详细的说明。此处描述的实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。实施例1、增强剂的配制方法增强剂原料包括甜菜碱和二甲基亚砜，其中甜菜碱的浓度为5M，溶剂为水，二甲基亚砜浓度为100％。配制方法为将5M甜菜碱与二甲基亚砜按8:1体积混匀。实施例2、在高GC含量基因位点分型中的应用1、待扩增的DNA序列此DNA区域的GC含量为76％，方括号内为待测位点。2、引物序列和探针序列根据待扩增的DNA序列，针对待测位点设计了表1所述的引物和探针。表1：实时荧光PCR的引物和探针序列引物与探针序列(5’-3’)GC含量(％)Tm值(℃)正向引物：gctgcaggcggcgcagg8268反向引物：cgaggcgcacccgcagc8269野生型探针：FAM-ggacgtgtgcggccgc-MGB8176突变型探针：VIC-ggacgtgcgcggccg-MGB86753、实时荧光PCR反应体系及程序按表2配制实时实时荧光PCR反应体系。表2组分每个反应体系中的体积Taq酶(6U/μL)0.5μLdNTP(10mM)0.4μLPCR缓冲液(2×)10μL正向引物(100μM)0.1μL反向引物(100μM)0.1μL野生型探针(100μM)0.05μL突变型探针(100μM)0.05μL模板2.0μL配置增强剂母液：增强剂包括甜菜碱和二甲基亚砜，其中甜菜碱的浓度为5M，溶剂为水，二甲基亚砜浓度为100％。实验组1：在表2的PCR反应体系中添加增强剂，并使得甜菜碱的终浓度为0.2M，二甲基亚砜的终浓度为1％(体积百分比)，用灭菌纯化水补足至20μL。实验组2：在表2的PCR反应体系中添加增强剂，并使得甜菜碱的终浓度为0.6M，二甲基亚砜的终浓度为1.5％(体积百分比)，用灭菌纯化水补足至20μL。实验组3：在表2的PCR反应体系中添加增强剂，并使得甜菜碱的终浓度为1.2M，二甲基亚砜的终浓度为2％(体积百分比)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强荧光PCR信号的试剂，包括增强剂，其特征在于，所述增强剂包括甜菜碱和二甲基亚砜。/n

【技术特征摘要】
1.一种增强荧光PCR信号的试剂，包括增强剂，其特征在于，所述增强剂包括甜菜碱和二甲基亚砜。


2.根据权利要求1所述的增强剂，其特征在于，增强剂中甜菜碱的浓度为5M。


3.根据权利要求1所述的增强剂，其特征在于，增强剂中二甲基亚砜为100％。


4.根据权利要求1所述的增强剂，其特征在于，增强剂中的甜菜碱和二甲基亚砜是分开的独立包装。


5.一种增强荧光PCR信号的方法，包括配置实时荧光PCR反应体系，其特征在于，在实时荧光PCR反应体系中添加增强剂，所述增强剂包括甜菜碱和二甲基亚砜。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，添加至实...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁佳女，郑宜文，周旭，
申请(专利权)人：杭州百迈生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33