一种基于生物基因的PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于生物基因的PCR检测方法，该生物基因的PCR检测方法包括如下步骤：设计特异性引物；提取细菌基因组DNA；优化PCR扩增条件；特异性试验；灵敏度试验和模拟污染试验。该生物基因的PCR检测方法具有特异性强、敏感度高和简便快捷的特点，以胎儿弯曲菌的蛋白基因为靶基因，应用软件设计特异性引物，并且通过反应条件的优化、引物敏感性、特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测，建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法，为以后临床样品检测提供了技术支持，同时，对识别胎儿弯曲菌菌株的暴发流行，相关疾病的诊断和控制具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物基因的PCR检测方法
本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种基于生物基因的PCR检测方法。
技术介绍
弯曲菌病原名孤菌病，是由弯曲菌引起的人和动物多种疾病的总称。除可引起腹泻外，还可造成不孕、乳房炎及禽类的传染性肝炎等疾病。对人除可引起腹泻和食物中毒外，也可造成流产、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎和脑膜炎等全身性感染。近年来，国内外从动物和人类分离到弯曲菌的报道日益增多。该病在世界各地的分布较广。目前该病已作为重要的人兽共患病而引起广泛重视。引起动物和人类疾病的主要是空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌。弯曲菌的菌体纤细，呈螺旋形、撇行、S形和鸥形等多种形态。在老龄培养物中呈螺旋状长丝或圆球形，运动力活泼。革兰氏染色阴性，微需氧，对营养要求较高。在含10％二氧化碳的环境中生长良好，于培养基内添加血液、血清有利于初代的培养。人感染后，潜伏期一般为3～5d，病情轻重不一。典型病人先有发热，全省无力，头痛，肌肉酸痛，婴儿还可发生抽搐临诊症状。继而腹痛，常局限于脐周，呈间歇性，有的呈隐痛，排便后可缓解。发热12～24h后开始腹泻，呈水样，每天排便5～10次，1～2d后部分病例出现黏液便或脓血便，经过1周可自行缓解，少数病例腹痛可持续数周，反复发生腹泻。近年来，弯曲菌常引起儿童肠道外感染，如败血症、脑膜炎、胆囊炎、腹膜炎、心内膜炎、血栓性静脉炎和反应性关节炎等。根据流行病史和临诊表现可怀疑为本病，确诊需进行细菌的分离鉴定。但细菌分离需要耗时2～7d才能确诊，胎儿弯曲菌的危害比较严重，而人们对于胎儿弯曲菌的特性却掌握得很少。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种基于生物基因的PCR检测方法，基于物种特异性PCR技术，建立胎儿弯曲菌特性快速检测的体制。本专利技术提出的一种基于生物基因的PCR检测方法，包括如下步骤：步骤一：设计特异性引物：从基因库中获取胎儿弯曲菌的特异性基因序列，打开软件primerpremier5.0设计特异性引物，引物要求与基因库中胎儿弯曲菌的同源性为100％；步骤二：提取胎儿弯曲菌基因组DNA；将胎儿弯曲菌接种放在无血弯曲菌琼脂中进行培养，微氧条件下进行培养，随后挑选菌落。并将其加入到培养基中并用移液枪吹匀，沸水煮沸过后取出立即放置在冰上，离心，吸取上清液并转移保存备用，同时提取两份细菌基因组DNA用于特异性试验、灵敏度试验和模拟污染试验；步骤三：优化PCR扩增条件；取胎儿弯曲菌的DNA模板和PCR预混液，上下游引物和灭菌去离子水混合在试管中并做离心处理，反应物集中到试管底部后进行PCR扩增；步骤四：特异性试验；用引物对胎儿弯曲菌进行PCR检测，并通过电泳实验对其进行观察；步骤五：灵敏度试验；用分光光度计测定胎儿弯曲菌的DNA模板的浓度后，分别梯度稀释，每个梯度各取来进行PCR扩增，并通过电泳观察比较条带亮度，直至不出现条带；步骤六：模拟污染试验。用磷酸缓冲盐溶液作梯度稀释，同时每个梯度做菌落技术，然后将每个稀释度各取菌液分别加入到污水，的奶牛粪便样品中，向样品加入增菌培养基，摇床培养，再提取DNA，再用PCR方法对阳性菌落进行计数。所述步骤一中的特异性引物通过软件primerpremier5设计的。所述步骤二中提取细菌基因组DNA时要备留三份用于特异性试验、灵敏度试验和模拟污染试验。所述步骤三中PCR扩增后保存备用的温度为4℃。所述步骤四中特异性试验时对胎儿弯曲菌进行PCR检测，并通过电泳观察PCR扩增结果。所述步骤五中灵敏度试验时采用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。所述步骤六中模拟污染试验采用培养基培养的方法。本专利技术提供的生物基因的PCR检测方法的优点在于：所建立的生物基因的PCR检测方法具有特异性强、敏感度高和简便快捷的特点，以胎儿弯曲菌的蛋白基因为靶基因，应用软件设计特异性引物，并且通过反应条件的优化、引物敏感性、特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测，建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法，为以后临床样品检测提供了技术支持，同时，对识别胎儿弯曲菌菌株的暴发流行，相关疾病的诊断和控制具有重要意义。具体实施方式下面将结合具体实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种基于生物基因的PCR检测方法，包括如下步骤：步骤一：设计特异性引物：从基因库中获取胎儿弯曲菌的特异性基因序列，打开软件primerpremier5.0设计特异性引物，引物要求与基因库中胎儿弯曲菌的同源性为100％；步骤二：提取细菌基因组DNA；将胎儿弯曲菌接种放在无血弯曲菌琼脂中进行培养，微氧条件下进行培养，随后挑选菌落。并将其加入到100微升培养基中并用移液枪吹匀，沸水煮沸5分钟过后取出立即放置在-15℃的冰上，离心，吸取上清液并转移至-20℃保存备用，同时提取两份细菌基因组DNA用于特异性试验、灵敏度试验和模拟污染试验；步骤三：优化PCR扩增条件；取胎儿弯曲菌的DNA模板2微升、PCR预混液12微升，上下游引物各1微升和灭菌去离子水9微升混合在试管中并做离心处理，反应物集中到试管底部后进行PCR扩增；步骤四：特异性试验；用引物对胎儿弯曲菌进行PCR检测，并通过电泳实验对其进行观察；步骤五：灵敏度试验；用分光光度计测定胎儿弯曲菌的DNA模板的浓度后，分别做10倍梯度稀释，每个梯度各取2微升进行PCR扩增，并通过电泳观察比较条带亮度，直至不出现条带；步骤六：模拟污染试验。用磷酸缓冲盐溶液作10倍梯度稀释，同时每个梯度做菌落技术，然后将每个稀释度各取10微升菌液分别加入到10毫升污水，10克的奶牛粪便样品中，向样品加入90毫升增菌培养基，37℃、0.03mg/l的氧气浓度的条件下、120r/min的摇床培养48小时，再提取DNA，再用PCR方法对阳性菌落进行计数。所述步骤一中的特异性引物通过软件primerpremier5设计的。所述步骤二中提取细菌基因组DNA时要备留三份用于特异性试验、灵敏度试验和模拟污染试验。所述步骤三中PCR扩增后保存备用的温度为4℃。所述步骤四中特异性试验时对胎儿弯曲菌进行PCR检测，并通过电泳观察PCR扩增结果。所述步骤五中灵敏度试验时采用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。所述步骤六中模拟污染试验采用培养基培养的方法。实施例1一种基于生物基因的PCR检测方法，包括如下步骤：步骤一：设计特异性引物：从基因库中获取胎儿弯曲菌的特异性基因序列，打开软件primerpremier5.0设计特异性引物，引物要求与基因库中胎儿弯曲菌的同源性为100％；步骤二：提取胎儿弯曲菌基因组DNA；将胎儿弯曲菌接种放在无血弯曲菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于生物基因的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一：设计特异性引物；/n步骤二：提取胎儿弯曲菌基因组DNA；/n步骤三：优化PCR扩增条件；/n步骤四：特异性试验；/n步骤五：灵敏度试验；/n步骤六：模拟污染试验。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于生物基因的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：设计特异性引物；
步骤二：提取胎儿弯曲菌基因组DNA；
步骤三：优化PCR扩增条件；
步骤四：特异性试验；
步骤五：灵敏度试验；
步骤六：模拟污染试验。


2.根据权利要求1所述的一种基于生物基因的PCR检测方法，其特征在于，所述步骤一中的特异性引物通过软件primerpremier5设计的。


3.根据权利要求1所述的一种基于生物基因的PCR检测方法，其特征在于，所述步骤二中提取细菌基因组DNA时要备留三份用于特异性试验、灵敏度试验和模拟污染试验。


4.根据权利要求1所述的一种基于生物基因的PCR检测方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：水庆亮，水守燕，
申请(专利权)人：六安市康恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34