基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于蛋白毒素检测领域，涉及一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法及试剂盒。本发明专利技术的方法主要有4个过程：冷冻构建金纳米探针，蓖麻毒素和金纳米探针竞争结合适配体，相对DNA步行器和指数扩增反应。本发明专利技术的方法和试剂盒可以在实际应用中以较高的灵敏度，良好的特异性和优异的稳定性检测蓖麻毒素。

【技术实现步骤摘要】
基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法及试剂盒
本专利技术属于蛋白毒素检测领域，具体地，涉及一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法，以及一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的试剂盒。
技术介绍
蓖麻是大戟科蓖麻属植物，为含油量较高的油料作物。但蓖麻植株的茎、叶或蓖麻的籽实中含有有毒物质，主要包括蓖麻毒素、蓖麻碱及蓖麻血球凝集素等。其中，蓖麻毒素也称蓖麻毒蛋白，是迄今所知毒性最强的植物毒蛋白，毒性约是氰化物的6000倍。蓖麻毒素主要存在于蓖麻蛋白中(约占蓖麻蛋白的5％，分子量约为64-66kD)，是一种Ⅱ型异二聚体核糖体失活蛋白，由核糖体失活酶(蓖麻毒素A链)及与半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特异结合的凝集素(蓖麻毒素B链)组成，二者之间由一个二硫键连接。在25℃时，蓖麻毒素可在较大范围的酸碱溶液中反复结冰和溶解，但其毒性仍保持不变。蓖麻毒素具有很强的毒性作用，毫克级的剂量即可致人或动物死亡。由于分布广泛、易于获得、致命性强等特点，被一些本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法，包括以下步骤：/n1)冷冻构建金纳米探针：采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，将巯基和PolyA双标记的DNA与三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐孵育，然后将制备的金纳米颗粒与DNA混合孵育，将溶液用HEPES缓冲液洗涤，最后将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，并在黑暗中保存；通过此方法分别合成AW和AT；/n所述AW为DNA Walker-金纳米探针，DNA Walker序列为：5'-SH-(A)

【技术特征摘要】
1.一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法，包括以下步骤：
1)冷冻构建金纳米探针：采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，将巯基和PolyA双标记的DNA与三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐孵育，然后将制备的金纳米颗粒与DNA混合孵育，将溶液用HEPES缓冲液洗涤，最后将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，并在黑暗中保存；通过此方法分别合成AW和AT；
所述AW为DNAWalker-金纳米探针，DNAWalker序列为：5'-SH-(A)20(T)15AACTATACAACCTCAGCATTAGTCAAGAGGTA-3'(SEQIDNO：1)；
所述AT为DNATrack-金纳米探针，DNATrack序列为：5'-SH-(A)20(T)15TACCTCTTGACTAATGCTGAGGTTGTATAGTT-3'(SEQIDNO：2)；
2)蓖麻毒素的竞争反应：反应前将蓖麻毒素适配体在高温孵育，然后逐渐冷却至室温，再将适配体和含蓖麻毒素的待测样品混合并孵育；反应结束后离心用PBS洗涤溶液；重悬沉淀，得到AW'；
所述蓖麻毒素适配体的序列为：5'-ATAGGAGTCACGACGACCAGAACCGTAGGTTCGGGGTCGGAGTGGTCCGGAAGATGGCGTGGTATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3'(SEQIDNO：3)；
3)相对DNA步行器过程：相对DNA步行包括：所述AW'，所述AT，Nb.BbvCI切口酶，缓冲液和水；
4)指数扩增反应：指数扩增反应体系包括：模板DNA、缓冲液、dNTP，ssDNA产物、ThermoPol缓冲液、Nt.BstNBI切口酶，Vent(exo-)DNA聚合酶，MgSO4和水；
所述模板DNA的序列为：5'-AACTATACAACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTCAA-3'(SEQIDNO：4)；
所述ssDNA产物的序列为5'-TGAGGTTGTATAGTT-3'(SEQIDNO：5)；
5)荧光强度测定：在反应前，将MB在高温孵育，然后在PBS中逐渐冷却至室温；然后，将MB溶液与步骤4)的扩增产物混合，并在室温下孵育；反应完毕后，使用荧光分光光度计测量荧光强度；
所述MB的序列为：5'-FAM-CTGGAGAACTATACAACCTCACTCCAG-BHQ1-3'(SEQIDNO：6)。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括制作蓖麻毒素标准曲线的步骤，根据步骤1)-5)测试不同浓度蓖麻毒素，通过荧光强度对不同浓度蓖麻毒素的响应，得到测定蓖麻毒素的标准曲线。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括实际样品预处理步骤：将实际样品在12000-13000rpm下离心5-15分钟，取上清并将其pH值调节至7.0。


4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，步骤1)包括：
采用柠檬酸钠还原法制备15nm左右的金纳米颗粒；将巯基和PolyA双标记的DNA与三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)以1：80-120的摩尔比在室温下孵育0.5-2小时；然后将2-5nM制备的金纳米颗粒与8-12μMDNA在-15℃至-25℃下以1：150-25-的摩尔比混合孵育30-150min；室温解...

【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，王瑜，彭媛，李双，韩殿鹏，任舒悦，秦康，韩铁，李森，孙璇，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12