突变的Benzonase核酸内切酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了突变的Benzonase核酸内切酶及其应用。本发明专利技术的突变的Benzonase核酸内切酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原可用于制备抗Benzonase核酸内切酶抗体以及用于制备用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒。使用本发明专利技术的ELISA检测试剂盒可以定量检测多种不同的Benzonase核酸内切酶产品。

【技术实现步骤摘要】
突变的Benzonase核酸内切酶及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及突变的Benzonase核酸内切酶及其应用。
技术介绍
Benzonase核酸内切酶来自于粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的对核酸具有非特异性偏好的细菌非特异核酸内切酶。早在1998年《FEMSMicrobiologyLetters》上一篇综序(Serratiamarcescensanditsextracellularnuclease)对其做了详细介绍，Benzonase核酸内切酶能降解包括单链、双链、线性、环状DNA和RNA以及基因组DNA在内的各种形式的核酸，对核酸序列没有偏好性，且不具备蛋白酶活性。并且，这篇综述有明确提到Benzonase核酸内切酶对宿主细胞具备毒性。成熟Benzonase核酸内切酶由信号肽分泌到胞外成熟，至2021年已知有三种具有相似生化特性的胞外亚型：Sm1、Sm2和Sm3。Sm2是没有信号肽序列的成熟Benzonase核酸酶(26.7KD)。相比Sm2，Sm1(26.4KD)缺乏前三个氨基酸，Sm3(26.6KD)缺乏前一个氨基酸。生物制品在生产过程中产生的核酸，需要专业的核酸去除剂。核酸酶能降解核酸，而非特异性核酸内切酶能非特异性地降解几乎所有形式的核酸，完全去除核酸，解决生物制品核酸残留危害问题。《生物技术药物研究开发和质量控制》王志军主编，第三版中，腺病毒纯化生产实例中列举了Canji公司、Bioreliance公司、Introgen公司以及Puresyn公司在腺病毒生产过程中应用了Benzonase核酸酶，并在非复制型病毒载体类基因治疗药物篇章中提到在重组腺病毒产品生产工艺中涉及核酸酶消化，且在重组人p53腺病毒注射液暂行质量标准中规定残留Benzonase，检测方法为ELISA法，规定标准应不高于1ng/支。在溶瘤腺病毒产品质量控制中，SG600-P53产品质量标准中规定残留Benzonase含量不高于1ng/支。2012年，BandeiraV等在纯化慢病毒颗粒载体的工艺过程中使用了Benzonase核酸酶，结果能去除99％的DNA残留。美国FDA网(www.fda.gov)公开了病毒载体的生产工艺流程，其中就涉及Benzonase核酸酶处理，37℃消化1小时，能有效去除细胞及质粒DNA。在宫颈癌疫苗GARDASIL的工艺流程中使用Benzonase核酸酶，4℃过夜处理病毒颗粒，降低宿主残留DNA，降低终产品中宿主DNA的残留量。可见该酶在未来几年内会广泛应用于医药产品，而该酶是外源性蛋白，具备生物活性，其残留可能引发机体过敏反应，导致临床不测事件发生，且已有部份病毒产品要求检其残留。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种突变的Benzonase核酸内切酶，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述突变的Benzonase核酸内切酶的基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。所述突变的Benzonase核酸内切酶可以作为抗原用于制备抗Benzonase核酸内切酶的抗体以及用于制备用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供一种用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒，所述试剂盒包含已包被捕获抗体的固相载体，所述捕获抗体为用所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原制备的抗体。所述捕获抗体为用所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原免疫兔获得的多克隆抗体。所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的用所述突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原制备的抗体。本专利技术的突变的Benzonase核酸内切酶具有低毒性和高免疫活性，可以作为抗原制备单克隆和多克隆抗体，从而制备用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒。使用本专利技术的ELISA检测试剂盒可以定量检测多种不同的Benzonase核酸内切酶产品。附图说明图1示出了pET-20b(+)载体的图谱。图2示出了SDS-PAGE电泳分析结果，其中Mark由上到下分别为：190KD，140KD，95KD，65KD，50KD，40KD，30KD，23KD；1：对照样品，Benzonase核酸内切酶；2：Be-P-1。图3示出了WesternBlot结果，其中Mark由上到下分别为：50KD，40KD，30KD，23KD；1：对照样品，Benzonase核酸内切酶；2和3：Be-P-1。图4示出了突变的Benzonase核酸内切酶的活性测定结果，其中Mark：100bp；1、2和3分别为：突变的Benzonase核酸内切酶(250ng)处理过的1.2μlDNA；0.6μlDNA和0.3μlDNA；4、5和6分别为：1.2μlDNA，0.6μlDNA，0.3μlDNA；7：Benzonase核酸内切酶(250ng，1KU)处理过的1.2μlDNA；DNA原浓度为10mg/ml。图5示出了ELISA检测中建立的标准曲线(r＝1)。具体实施方式以下结合具体实例对本专利技术作进步说明，其仅用于阐述本专利技术而非限制本专利技术范围。实施例1.突变的Benzonase核酸内切酶构建Be-P-1菌株根据文献报道(GenBank：M19495.1，UniProtKB/Swiss-Prot：P13717)的粘质沙雷菌(S.marcescens)核酸酶(Benzonase核酸内切酶或Benzonase核酸酶)基因序列及氨基酸序列，设计突变的Benzonase核酸内切酶，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，氨基酸序列如序列表中序列2所示。送武汉擎科生物科技有限公司合成突变的Benzonase核酸内切酶基因。构建表达突变的Benzonase核酸内切酶的重组表达载体。选择pET-20b(+)作为表达载体，如图1所示。选择BL21(DE3)pLysS作为表达菌株。设计一对引物：引物1和引物2。引物1和引物2分别如序列表中序列3和序列4所示，基因5’端引物带有NcoI酶切位点和6×His，3’端引物带有HindIII酶切位点和基因终止密码子。在0.2mlPCR微量离心管中配制25μl反应体系：Q5High-Fidelity2×MasterMix12.5μ110μM引物11.25μl10μM引物21.25μl模板稀释至14.9ng/ml加2μl无核酸酶水8μlPCR反应程序：98℃预变性30秒；98℃10秒，57℃30秒，72℃1min，共30个循环；最后72℃2min。PCR反应结束后取5μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小与设计的大小777bp一致。用NcoI、HindIII双酶切pET-20b(+)质粒与PCR反应后的突变的Benzonase核酸内切酶基因片段的回收产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变的Benzonase核酸内切酶基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种突变的Benzonase核酸内切酶基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。


2.一种突变的Benzonase核酸内切酶，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。


3.权利要求2所述的突变的Benzonase核酸内切酶作为抗原在制备抗Benzonase核酸内切酶抗体中的用途。


4.权利要求2所述的突变的Benzonase核酸内切酶在制备用于检测Benzonase核酸内切酶的ELISA试剂盒中的用途。


5.一种用于检测Benzonase核...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱香，梁雅丽，卢宁，牛林茹，杨凌，郭芳，李文慧，
申请(专利权)人：山西集创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西;14