非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种可用作疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株及其构建方法，该病毒株是亲本非洲猪瘟病毒ASFV CN/GS/2018分离株的基因缺失弱毒株。本发明专利技术发现了DP71L基因是对猪致病性致弱的新靶标基因，并发现联合丧失MGF360‑18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能，降低了亲本毒株的毒性，获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选疫苗株；所述减毒非洲猪瘟候选疫苗株高剂量(10

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用本申请要求申请日为2020年7月10日、申请号为CN202010661680.7、专利技术名称为“非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用”的在先申请的优先权，该在先申请的全部内容均已在本申请中体现。
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白功能丧失的非洲猪瘟基因缺失弱毒株的构建及其作为疫苗的应用。
技术介绍
非洲猪瘟(AfricanSwineFever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。当前没有商品化的有效疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，而且需要花费漫长的时间，无法满足我国规模化养猪的需求。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于我国规模养猪模式下的非洲猪瘟的防治至关重要。但非洲猪瘟病毒(ASFV)结构复杂、基因组庞大，大部分功能未知，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，其流行已逾百年，但仍未有商品化的疫苗问世。目前对于非洲猪瘟疫苗的制备主要通过三种方式：一是直接对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二是筛选出有效诱导免疫应答的病毒蛋白，进而制备亚单位疫苗和活载体疫苗；三是采用基因缺失手段，敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲猪瘟病毒编码免疫抑制、免疫耐受和抗体依赖增强作用(ADE)等蛋白，灭活疫苗免疫猪体内无法提供有效的免疫保护作用；第二种方法的困难在于非洲猪瘟病毒结构复杂，目前诱导免疫应答的蛋白还未清楚，获得的抗原还不足以诱导坚强的免疫保护作用。而目前最有望突破的疫苗就是基因敲除疫苗，通过对免疫抑制、耐受、ADE等毒力相关基因的敲除，获得既具有免疫原性，又能降低致病性，免疫猪获得免疫保护作用的疫苗候选毒株。例如，中国专利CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株，该弱毒株是非洲猪瘟病毒SY18分离株的四基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物和三个多基因家族基因(MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L)编码产物，接种仔猪免疫28天后，以ASFV原始毒进行攻毒试验，结果免疫猪群均获得完全保护；又如中国专利CN110093324B公开了一种基因Ⅱ型的非洲猪瘟病毒MGF360-505R缺失和CD2V与MGF360-505R联合缺失的基因缺失病毒，这两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，这两株基因缺失病毒免疫后21天能够提供充分的强毒攻击保护。综上，对于猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性，又要兼顾致病性和安全性能。但是现有技术中猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗还是存在如下问题：①不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分还会有毒力和致病性残留，以及多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险；②敲除的毒力基因是否减少带毒和排毒是生物安全的一个重要指标，最好能够获得免疫清除的疫苗候选毒株，减少散毒和排毒的风险；③非洲猪瘟的全基因组测序工作虽然已经完成，但是组成非洲猪瘟病毒的调控基因和结构基因高达160多个，虽然对所有基因的功能进行研究是一项巨大的工程，但全面研究每一个调控基因和结构基因的功能对其致病机理和疫苗研制至关重要。因此，在非洲猪瘟减毒疫苗的制备过程中，鉴定基因功能及其对致病性和免疫应答的影响，为敲除靶标基因的选择和基因敲除的构建提供依据，新靶标基因的筛选至关重要，决定着疫苗候选株的安全性和免疫有效性。本专利技术发现DP71L具有较强的免疫抑制作用，是新发现的新靶标基因；在非洲猪瘟原始毒株中联合缺失DP71L、DP96R和MGF360-18R基因，获得了一株肌肉注射高剂量(每头猪免疫104HAD50)猪仍不发病的基因缺失毒株，与免疫猪同居的猪的核酸和抗体均是阴性，显示该毒株肌肉注射不能够致猪发病死亡、无水平传播现象，表明它是安全性良好的减毒非洲猪瘟病毒株。本专利技术的非洲猪瘟病毒弱毒株能对ASFV亲本毒株的攻击提供完全的免疫保护作用，且安全性高，适于作为预防非洲猪瘟的疫苗候选株。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种构建非洲猪瘟减毒株的策略，所述策略是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术提供了一种通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合丧失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用。优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFVCN/GS/2018分离株、China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFVCzechRepublic2017/1、ASFVMoldova2017/1、ASFVBelgium2018/1、ASFVGermany2020/1、ASFVArm/07/CBM/c2、ASFVKen.rie1、ASFVWuhan2019-2、ASFV_HU_2018、ASFV/pig/China/CAS19-01/2019中的任一种。优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFVCN/GS/2018分离株，所述ASFVCN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQIDNO.20所示。优选地，所述MGF360-18R基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述DP71L基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述DP96R基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。优选地，所述MGF360-18R基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述DP71L基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述DP96R基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。第二方面，本专利技术提供了一种通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合丧失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能制备非洲猪瘟疫苗的应用。优选地，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFVCN/GS/2018分离株、China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Geo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合丧失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用。/n

【技术特征摘要】
20200710 CN 20201066168071.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合丧失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用。


2.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合丧失MGF360-18R基因、DP71L基因和DP96R基因编码蛋白的功能制备非洲猪瘟疫苗的应用。


3.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合缺失基因片段制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF360-18R基因的全部或部分核苷酸序列、DP71L基因的全部或部分核苷酸序列和DP96R基因的全部或部分核苷酸序列。


4.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中联合缺失基因片段制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因片段包括MGF360-18R基因的全部或部分核苷酸序列、DP71L基因的全部或部分核苷酸序列和DP96R基因的全部或部分核苷酸序列。


5.如权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFVCN/GS/2018分离株、China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、ASFV/Pol17_04461_C210、ASFV/Pol16_20186_o7、ASFV/Pol17_03029_C201、ASFV/Pol16_20540_o10、ASFVCzechRepublic2017/1、ASFVMoldova2017/1、ASFVBelgium2018/1、ASFVGermany2020/1、ASFVArm/07/CBM/c2、ASFVKen.rie1、ASFVWuhan2019-2、ASFV_HU_2018、ASFV/pig/China/CAS19-01/2019中的任一种。


6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFVCN/GS/2018分离株，所述ASFVCN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQIDNO.20所示。


7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述缺失的基因片段为ASFVCN/GS/2018分离株全长序列的第184062-184456位。


8.一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为基因片段缺失的基因Ⅱ型非洲猪病毒，所述基因片段包括MGF360-18R基因的全部或部分核苷酸序列、DP71L基因的全部或部分核苷酸序列和DP96R基因的全部或部分核苷酸序列。


9.如权利要求8所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒包括ASFVCN/GS/2018分离株、China/2018/AnhuiXCGQ、Pig/CN/HLJ/2018、Georgia2007、ASFV-SY18、ASFV/POL/2015/Podlaskie、ASFV/Pol17_05838_C220、ASFV/Pol16_29413-o23、ASFV/Pol16_20538_o9、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，李攀，冯涛，齐晓兰，刘华南，张克山，李丹，吴盼雪，马昭，党文，刘迎琦，石正旺，杨波，田宏，郭建宏，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62