一种抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用。所述旁侧序列，其为外源插入片段的5’端旁侧序列，具体为SEQ ID NO.9所示的序列或其特异性片段；和/或，其为外源插入片段的3’端旁侧序列，具体为SEQ ID NO.10所示的序列或其特异性片段；抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20180。运用本发明专利技术的旁侧序列可对是否成功获得抗虫转基因玉米事件AM63进行有效判断，为监管抗虫转基因玉米AM63及其后代等提供了有力的保障。

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用。
技术介绍
虫害(尤其是玉米螟害)会造成玉米的严重减产，抗虫转基因玉米是世界上最早开展的研究性状之一。抗虫基因主要来源于苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，其作用机理是使昆虫胃肠产生穿孔，从而使昆虫代谢紊乱而死亡。孟山都公司是转基因抗虫玉米研发与应用的领跑者，其开发的抗虫转基因玉米MON810和MON863都已经进入商品化生产多年。在MON810转基因玉米中表达的Cry1Ab蛋白能有效防治玉米螟，在MON863中表达的Cry3Bb对危害玉米根部的害虫有很好的防治效果。先正达公司也开发了表达Cry1Ab蛋白的转基因抗虫玉米BT11和BT176。先锋公司和陶氏公司共同开发了含Cry34和Cry35的抗玉米根部害虫的转基因玉米。丁群星等(1993)首次报道了用子房注射法将Bt毒蛋白基因导入玉米；王国英等(1995)用玉米悬浮细胞、愈伤组织和幼胚作受体，通过基因枪轰击法成功地将Bt毒蛋白基因转入玉米细胞，并获得了大量转基因植株；周逢勇等(1998)将Bt杀虫蛋白导入玉米自交系P9-10，外源基因能稳定遗传到转基因植株后代。张艳贞等(2002)对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究。截止目前，国产转基因植酸酶玉米BVLA430101、抗虫耐除草剂玉米DBN9936、瑞丰125和耐除草剂玉米DBN9858已被认为符合安全标准。随着转基因玉米的商业化应用将加快玉米产业升级。为今后转基因玉米的可持续利用，有必要研发更多的抗性优良转化体。我们将改造的cry1Ab基因(专利申请号202010553528.0)和cry1m7基因(专利号201410591794.3)构建转化载体p3301UbiAbUbiM7，通过农杆菌介导法转入到玉米基因组中，获得了一个抗虫转基因玉米事件AM63，今后有可能进入商业化种植。对转基因玉米进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因玉米进行监督管理。而外源插入片段的旁侧序列和依据此旁侧序列建立的检测方法，是进行监督管理的一个重要指标。因此有必要获得转基因玉米AM63的旁侧序列，并建立鉴定体系以备对此事件的监督管理。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可对抗虫转基因玉米事件AM63进行有效监管的方法。本专利技术所述抗虫转基因玉米事件AM63以种子的形式，于2021年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为玉米Zeamays，保藏编号为CGMCCNO.20180。具体地，本专利技术提供如下技术方案：抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列，其为外源插入片段的5’端旁侧序列，具体为SEQIDNO.9所示的序列或其特异性片段；和/或，其为外源插入片段的3’端旁侧序列，具体为SEQIDNO.10所示的序列或其特异性片段；抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.20180。本专利技术另提供：用于检测抗虫转基因玉米事件AM63的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.15或SEQIDNO.16所示。上述旁侧序列或DNA片段在检测转基因玉米AM63中的应用。用于扩增上述DNA片段的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.11-12或SEQIDNO.13-14所示。用于检测抗虫转基因玉米AM63的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.11-12或SEQIDNO.13-14所示。用于检测抗虫转基因玉米AM63的试剂盒，其含有上述的特异性引物对。一种检测抗虫转基因玉米AM63的方法，其以样品总DNA为模板，利用上述的特异性引物对进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。上述方法中，当采用核苷酸序列如SEQIDNO.11-12所示的特异性引物对，对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为716bp，则待测样品含有玉米AM63来源的成分；若采用核苷酸序列如SEQIDNO.13-14所示的特异性引物对，对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为583bp，则待测样品含有玉米AM63来源的成分。本专利技术还提供上述特异性引物对或试剂盒在检测转基因玉米AM63亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。本专利技术再提供一种培养对昆虫具有抗性的玉米的方法，其包括种植玉米种子，所述玉米种子的基因组中包含SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.15或SEQIDNO.16所示的序列。本专利技术的抗虫转基因玉米事件AM63按如下方式获得：将载体pCambia3301上的gus基因换成cry1m7基因，35S启动子换成玉米Ubiquitin启动子，构建植物表达载体p3301UbiM7；同时，将Ubiquitin启动子-Cry1Ab-NOS终止子表达框构建到载体p3301UbiM7上，从而构建植物表达载体p3301UbiAbUbiM7。在T-DNA区结构为35SpolyA终止子-bar基因-35S启动子-ubiquitin启动子-cry1Ab基因-NOS终止子-ubiquitin启动子-cry1m7基因-NOS终止子，大小约为10.7kb。载体图谱如图1所示。将载体p3301UbiAbUbiM7通过冻融法转入农杆菌LBA4404中。剥取授粉12天大小为1-1.5mm左右的玉米自交系综31的幼胚，用农杆菌进行侵染。然后再共培养3天，恢复7天后分别用含1.5mg/L，3mg/Lbialaphos(双丙氨膦)的培养基上筛选四轮。筛选得到的愈伤分化成苗，转入土中使转基因植株生长并进行授粉结实。对转基因植株进行PCR鉴定得到抗虫转基因玉米AM63。对转基因玉米进行温室及田间喷施草铵膦以选择阳性苗。经PCR及转基因后代基因分离鉴定实验，转化载体中的目的基因cry1Ab和选择标记基因bar单拷贝整合到AM63基因组中，在转基因植株能稳定遗传；转化载体中的目的基因cry1m7没有整合到玉米基因组中。通过三代测序等方法鉴定外源基因整合到玉米第3号染色体214Mb附近，明确了插入序列上下游旁侧序列。本专利技术提供了抗虫转基因玉米事件AM63(Zeamays)插入位点的外源插入片段的5’端和3’端旁侧序列，其具有SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的序列或其特异性片段。特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异地检测转基因事件。如用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的探针进行杂交，或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增，检测特异条带等。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列，其为外源插入片段的5’端旁侧序列，具体为SEQ ID NO.9所示的序列或其特异性片段；/n和/或，其为外源插入片段的3’端旁侧序列，具体为SEQ ID NO.10所示的序列或其特异性片段；/n抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20180。/n

【技术特征摘要】
1.抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列，其为外源插入片段的5’端旁侧序列，具体为SEQIDNO.9所示的序列或其特异性片段；
和/或，其为外源插入片段的3’端旁侧序列，具体为SEQIDNO.10所示的序列或其特异性片段；
抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.20180。


2.用于检测抗虫转基因玉米事件AM63的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.15或SEQIDNO.16所示。


3.权利要求1所述的旁侧序列或权利要求2所述的DNA片段在检测转基因玉米AM63中的应用。


4.用于扩增权利要求2所述的DNA片段的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.11-12或SEQIDNO.13-14所示。


5.用于检测抗虫转基因玉米AM63的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.11-12或SEQIDNO.13-14所示。


6.用于检测抗虫转基因玉米AM63的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘允军，王国英，刘艳，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11