一种防治太子参病害的假单胞菌以及分离筛选鉴定方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种防治太子参病害的假单胞菌以及分离筛选鉴定方法与应用。本研究从太子参植株中分离得到了假单胞菌，具有较强的抗逆性，对人畜无毒无害，对环境友好。同时该菌对太子参的叶斑病、立枯病、根腐病、紫纹羽病等多种病原菌具有明显的抑制作用，可作为生防杀菌剂用于太子参多种真菌性病害的防治。

【技术实现步骤摘要】
一种防治太子参病害的假单胞菌以及分离筛选鉴定方法与应用
本专利技术涉及植物病害防治
，具体涉及一种防治病害的假单胞菌以及分离筛选鉴定方法与应用。
技术介绍
太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)PaxexPaxetHoffm.的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺的功效。现代药理学研究表明太子参具有降糖、改善慢性心衰、抗氧化活性等作用。在人工栽培过程中，太子参存在严重的连作障碍问题，主要表现为病害频发，常见病害有立枯病、叶斑病、根腐病等，发病率逐年加重，相关报道表明，同地块上连作2年比正茬的减产30％左右，连作3年以上的比正茬的减产50％以上，导致太子参药材产量和质量下降，给药农造成较大经济损失。在太子参病害防治过程中，目前参农主要是使用霜霉威盐酸盐、氟吡菌胺、溴氰菊酯等化学药剂来对病害进行防治，但过量使用化学药品会导致生态平衡破坏、农药残留量增加、病原菌抗药性提高、土壤呈强酸化等不良影响。寻找一类既能保护环境也能够有效预防植物病害的新方法成为当下太子参栽培过程中急需解决的问题。在农作物、蔬菜、水果中病害防治中，我国目前生物农药制品中比较成熟有200多种，针对中药材病害防治的生物农药比较少。本研究中从太子参植株中分离得到了假单胞菌，具有较强的抗逆性，对人畜无毒无害，对环境友好。同时该菌对太子参的叶斑病、立枯病、根腐病、紫纹羽病等多种病原菌具有明显的抑制作用，可作为生防杀菌剂用于太子参多种病原菌病害的防治。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种防治太子参病害的假单胞菌BBH16-1；本专利技术的另一目的是提供一种防治病害的假单胞菌分离筛选方法；本专利技术的另一目的是提供一种防治病害的假单胞菌鉴定方法；本专利技术的另一目的是提供假单胞菌BBH16-1菌株在制备太子参拮抗剂中的应用。本专利技术的另一目的是提供的假单胞菌BBH16-1菌株在制备镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌、球毛壳菌、裂褶菌、鸡腿菇菌、黑外皮球菌、可可毛色二孢菌、微扁沃利雅炭皮菌等太子参病原菌拮抗剂中的应用。本专利技术所述假单胞菌为假单胞菌BBH16-1。本专利技术所述的假单胞菌BBH16-1的分离筛选方法具体为：1)收集新鲜的太子参叶片和块根用水冲洗干净；2)用灭菌的剪刀切成碎片置于研钵中；3)按照0.5～1.5g叶片和块根组织加入10mLPBS溶液，超声15～25min后收集悬液，采用10倍体积比例依次稀释至10-2，得到含菌稀释液；4)取10-2稀释浓度的100μL含菌稀释液涂布于PDA平板上，每个处理三个重复；5)25～30℃培养1～3d后，挑取表型差异的单菌落划线于LB培养基进行纯化培养；6)鉴定分离的菌株假单胞菌；7)采用平皿对峙培养法筛选假单胞菌；镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌接种于PDA培养基平板表面,20～30℃培养2～4d制备新鲜菌丝；8)用1mL枪头打孔挑取新鲜镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌丝块，接种于PDA平板中央，同时在其四周3cm处等距的四点分别接种培养20～28h的细菌菌液，以接菌大肠杆菌DH5α为阴性对照，每个处理重复三次；9)所有处理于20～30℃下培养2～4d，即得假单胞菌：假单胞菌BBH16-1。优选的，本专利技术所述的假单胞菌BBH16-1的分离筛选方法具体为：1)收集新鲜的太子参叶片和块根用水冲洗干净；2)用灭菌的剪刀切成碎片置于研钵中；3)按照1g叶片和块根组织加入10mLPBS溶液，超声20min后收集悬液，采用10倍体积比例依次稀释至10-2，得到含菌稀释液；4)取10-2稀释浓度的100μL含菌稀释液涂布于PDA平板上，每个处理三个重复；5)28℃培养2d后，挑取表型差异的单菌落划线于LB培养基进行纯化培养；6)鉴定分离的菌株假单胞菌；7)采用平皿对峙培养法筛选假单胞菌；镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌接种于PDA培养基平板表面,25℃培养3d制备新鲜菌丝；8)用1mL枪头打孔挑取新鲜镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌丝块，接种于PDA平板中央，同时在其四周3cm处等距的四点分别接种培养24h的细菌菌液，以接菌大肠杆菌DH5α为阴性对照，每个处理重复三次；9)所有处理于25℃下培养3d，即得假单胞菌：假单胞菌BBH16-1。本专利技术所述PDA培养基的配方如下：马铃薯160～230g，葡萄糖15～25g，磷酸二氢钾0.5～2.1g，七水硫酸镁0.3～0.7g，琼脂10～20g。优选的，本专利技术所述PDA培养基的配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾1.5g，七水硫酸镁0.5g，琼脂15g。本专利技术所述的PDA培养基的制作方法如下：将马铃薯煮沸4～6min后用纱布过滤收集滤液，添加葡萄糖，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，琼脂，蒸馏水定容至0.5～1.5L。本专利技术所述LB培养基的配方如下：胰蛋白胨5～15g，酵母提取物2～8g，氯化钠5～15g，琼脂10～20g,蒸馏水定容至0.5～1.5L。优选的本专利技术所述LB培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L。本专利技术所述鉴定方法包括形态学鉴定及生物学鉴定，具体如下：1)形态学鉴定将假单胞菌BBH16-1菌株接种到LB培养基培养48h后，可见LB培养基上菌落黄白色菌落，菌落圆形，边缘整齐透明。2)分子生物学鉴定将假单胞菌BBH16-1菌株于LB培养基培养48h后，采用CTAB/NaCl提取方法提取基因组DNA，提取后先后用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇(24:1)抽提和无菌水溶解，利用特异性引物扩增V3V4rDNA并测序，测序序列长度为408bp，序列编号为SEQIDNO.1；测序引物DNA序列：V3V4rDNA(正向引物)：CTACGGGMSGCAGCAG；V3V4rDNA(反向引物)：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；在NCBI中GenBank数据库中，将BBH16-1菌株的V3V4rDNA序列采用BLASTn检索，鉴定。本专利技术所述的假单胞菌BBH16-1菌株在制备中药材及农作物拮抗剂中的应用。优选的，本专利技术所述假单胞菌BBH16-1菌株在制备镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌、球毛壳菌、裂褶菌、鸡腿菇菌、黑外皮球菌、可可毛色二孢菌、微扁沃利雅炭皮菌等太子参病原菌拮抗剂中的应用。有益效果：本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：1、现有技术存在的问题：在太子参病害防治过程中，目前参农主要是使用霜霉威盐酸盐、氟吡菌胺、溴氰菊酯等化学药剂来对病害进行防治，但过量使用化学药品会导致生态平衡破坏、农药残留量增加、病原菌抗药性提高、土壤呈强酸化等不良影响。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种防治太子参病害的假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌为假单胞菌BBH16-1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020971。/n

【技术特征摘要】
1.一种防治太子参病害的假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌为假单胞菌BBH16-1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2020971。


2.根据权利要求1所述的假单胞菌的分离筛选方法，其特征在于，所述方法具体为：
1)收集新鲜的太子参叶片和块根用水冲洗干净；
2)用灭菌的剪刀切成碎片置于研钵中；
3)按照0.5～1.5g叶片和块根组织加入10mLPBS溶液，超声15～25min后收集悬液，采用10倍体积比例依次稀释至10-2，得到含菌稀释液；
4)取10-2稀释浓度的100μL含菌稀释液涂布于PDA平板上，每个处理三个重复；
5)25～30℃培养1～3d后，挑取表型差异的单菌落划线于LB培养基进行纯化培养；
6)鉴定分离的菌株假单胞菌；
7)采用平皿对峙培养法筛选假单胞菌；
镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌接种于PDA培养基平板表面,20～30℃培养2～4d制备新鲜菌丝；
8)用1mL枪头打孔挑取新鲜镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌丝块，接种于PDA平板中央，同时在其四周3cm处等距的四点分别接种培养20～28h的细菌菌液，以接菌大肠杆菌DH5α为阴性对照，每个处理重复三次；
9)所有处理于20～30℃下培养2～4d，即得假单胞菌：假单胞菌BBH16-1。


3.根据权利要求2所述的分离筛选方法，其特征在于，所述方法具体为：
1)收集新鲜的太子参叶片和块根用水冲洗干净；
2)用灭菌的剪刀切成碎片置于研钵中；
3)按照1g叶片和块根组织加入10mLPBS溶液，超声20min后收集悬液，采用10倍体积比例依次稀释至10-2，得到含菌稀释液；
4)取10-2稀释浓度的100μL含菌稀释液涂布于PDA平板上，每个处理三个重复；
5)28℃培养2d后，挑取表型差异的单菌落划线于LB培养基进行纯化培养；
6)鉴定分离的菌株假单胞菌；
7)采用平皿对峙培养法筛选假单胞菌；
镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌接种于PDA培养基平板表面,25℃培养3d制备新鲜菌丝；
8)用1mL枪头打孔挑取新鲜镰刀菌、链格孢菌、富克葡萄孢盘菌、米根霉菌丝块，接种于PDA平板中央，同时在其四周3cm处等距的四点分别接种培养24h的细菌菌液，以接菌大肠杆菌DH5α为阴性对照，每个处理重复三次；
9)所有处理于25℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁青松，周涛，江维克，王小爱，汪露，欧小宏，肖承鸿，
申请(专利权)人：贵州中医药大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52