一种透明质酸酶抑制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种透明质酸酶抑制剂及其制备方法。将腺苷七肽MATGNAD用于制备透明质酸酶抑制剂，腺苷七肽在透明质酸酶抑制剂中的质量分数为90%，制备工艺简单方便，效率高，环境污染小，可实现大规模产业化的生产。该透明质酸酶抑制剂对抑制透明质酸酶的抑制效率高，副作用小，耐高温、耐高湿、稳定性好，可用于制备透明质酸产品，在皮肤护理产品、饲料添加剂、生物兽药、食品添加剂等方面具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸酶抑制剂及其制备方法
本专利技术涉及一种透明质酸酶抑制剂及其制备方法，属于饲料添加剂、生物兽药以及化妆品添加剂领域。技术背景透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)亦称扩散因子，是透明质酸的水解酶，可以降解组织中的透明质酸，从而提高组织中液体渗透能力。透明质酸酶在人体分为内源性和外源性两种，内源性透明质酸酶主要是动物体自身产生。内源性透明质酸酶是过敏反应的参与者，透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，各种肥大细胞释放的组胺能调节透明质酸酶活性，从而增加组织通透性，引发炎症和过敏反应，故透明质酸酶是抗炎和抗过敏的重要研究对象(胡国胜，用体外炎症反应模型测定多种中草药成分的抗炎效果，中国化妆品学术研讨会，2002)。一些革兰氏阳性病原菌如链球菌、葡萄球菌、产气荚膜梭菌等也会产生毒力因子—外源性透明质酸酶，从而有利于细菌或者其它毒素在组织中扩散(刘勇，细菌来源透明质酸酶研究进展，国外医药抗生素分册，2010，31卷第2期)。一些动物毒液中存在高活性的透明质酸酶，降解血管周围基质中的透明质酸使毒素易于进入血管，是毒液从受伤部位进入体循环的关键(苏康，透明质酸酶的研究进展，生物技术通报，2014)。产气荚膜梭菌是引起家禽生产性能下降和坏死性肠炎的主要病原菌。许多研究表明，家禽肠道中产荚膜梭菌浓度104-105CUF/g食糜，可引起亚临床症状，导致料肉比下降，养殖效益下降，而浓度大于106CUF/g食糜时，可导致坏死性肠炎，死亡率增加。而透明质酸酶是产气荚膜梭菌的主要的毒力因子之一，其可以破坏组织，导致细菌和其他毒素进一步扩散，从而引起严重的家禽疾病。透明质酸酶抑制剂具有广泛的用途，其可以添加于化妆品中，不但能增强制剂作用的持久性，还能缓减皮肤炎症和过敏反应(专利CN201210495829.4)，还可以用于抗过敏和抗炎症的药物治疗，在医药领域具有重大的应用前景。目前的传统的透明质酸酶抑制剂主要有植物提取物(如生物碱、黄酮类化合物、萜类化合物等)、壳聚糖、和一些抗炎症药物。仙人草提取物、积雪草甙、藤茶黄酮和鸢尾苷是几种常见的透明质酸酶抑制剂，可以通过抑制透明质酸酶活性，减少透明质酸的降解，保证了真皮层透明质酸的含量，从而提高皮肤的保湿效果，并且对抗敏起相应的作用、在化妆品、保健品以及药品中具有重要的应用(胡国胜，用体外炎症反应模型测定多种中草药成分的抗炎效果，2002年中国化妆品学术研讨会论文集；孙培冬，刘超，王小洪，鸢尾苷对透明质酸酶抑制作用的研究，化学通报，2013，857～860；王小洪，孙培冬，杨柳青等，藤茶中粗提物对透明质酸酶的抑制研究，第九届中国化妆品学术研讨会论文集，2012；CN201710705705.7一种具有抗敏和保湿活性的射干鸢尾苷及制备方法和应用)，但这些植物提取物工艺，由于受制于不同产地、不同季节采摘等因素，造成不同批次有效成分含量差异大，纯度不高，对透明质酸的抑制作用不强，效果不稳定。腺苷七肽(又名杆菌七肽、microcinC7肽)是由肠杆菌属、乳杆菌属等微生物分泌的一种细菌素类抗菌肽，其由7个氨基酸残基组成的肽，C端通过N-酰磷酰胺键与5'-磷酸腺苷(AMP)所结合形成小分子量抗菌肽，具有一定的抗菌能力(冉仁森，中国科学院大学，硕士学位论文，2017)。腺苷七肽的N端的蛋氨酸(Met)残基和C端的天冬氨酸(Asp)为其保守序列，不同的微生物分泌的腺苷七肽中间的五个氨基酸残基有所差异(OlgaBantysh，mBio，2014，5(3)：e01059-14)。本单位从益生菌约氏乳杆菌(CGMCC.NO19858)经过色谱法分离其不同发酵代谢产物成分，从中得到一种小肽，根据其结构，命名为腺苷七肽(专利CN202010720092.6一种约氏乳杆菌及其制备的腺苷七肽、制备方法)，腺苷七肽具有抗菌和免疫调节的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种透明质酸酶抑制剂及其制备方法，以及透明质酸酶抑制剂的在制备透明质酸相关产品中的应用，本专利技术的目的是通过以下措施实现的：本专利技术提供了腺苷七肽在制备透明质酸酶抑制剂中的应用。上述腺苷七肽的氨基酸序列为MATGNAD。本专利技术还提供了一种透明质酸酶抑制剂，以腺苷七肽作为活性成分，优选地，腺苷七肽在透明质酸酶抑制剂中的质量百分数为90％。本专利技术还提供了一种透明质酸酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将约氏乳杆菌(CGMCC.NO19858)接种于50mLMRS肉汤培养基，培养11-12小时，再扩增于5LMRS肉汤培养基，继续培养10小时。步骤2：将步骤1的5L约氏乳杆菌培养物接种于灭菌种子罐，加入50L种子培养基，5％NaOH调节pH＝6.0～6.5，保持溶氧DO<10％，培养8～10小时，直至种子罐pH恒定不再下降。步骤3：将种子罐发酵液泵如发酵罐中，加入500L发酵培养基，5％NaOH调节pH＝6.0～6.5，保持溶氧DO<10％，并每隔4小时测定腺苷七肽的含量，培养10～12小时)，直至发酵罐pH恒定不再下降，且腺苷七肽的含量达到4g/L，停止发酵；步骤4：发酵液经过碟式离心机分离菌体和清液，分离因素12000G，进料压力0.1Mpa，清夜进入50nm陶瓷膜，通水量600～800L/m2·h-1进一步分离，清液通过1500Da分子量超滤膜和300Da纳滤膜进行截留除杂，获得300～1500Da分子量的液体。步骤5：将步骤4所获液体通过层析柱纯化分离，分离条件如下：A相：水，B相：乙腈，洗脱条件：0～50min：95％A，5％B；50～80min：85％A，15％B；80～180min：55％A，45％B；180～250min：5％A，95％B；收集140～160min液体，冷冻干燥，条件为-80～-45℃，压力-0.05MPa，干燥1.5～2小时，即得到90％纯度的腺苷七肽。上述制备方法中，所述种子培养基由蛋白胨、酵母提取液、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、磷酸氢二钾、七水硫酸镁组成，其中蛋白胨1％，酵母提取液1％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.02％，以质量分数计算。所述发酵培养基由蛋白胨、酵母提取液、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、磷酸氢二钾、七水硫酸镁组合，其中蛋白胨1.5％，酵母提取液1.5％，葡萄糖3％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸氢二钾0.4％，七水硫酸镁0.02％，以质量百分比计算。本专利技术还提供了一种透明质酸产品，包含上述透明质酸酶抑制剂，优选地，透明质酸酶抑制剂中腺苷七肽的质量分数为90％。进一步地，上述透明质酸产品为透明质酸皮肤护理产品和生物兽药用品，透明质酸皮肤护理产品包括：保湿品、化妆水、精华素、洗面奶、沐浴液。进一步地，上述透明质酸皮肤护理产品包还包括pH调节剂、防腐剂、功效成分和水。优选地，一种透明质酸保湿品，含1％的透明质酸钠含量，0.6％的腺苷七肽，以质量百分比计算，保湿品的pH为6.8～7.0。本专利技术还提供了一种饲料本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.腺苷七肽在制备透明质酸酶抑制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.腺苷七肽在制备透明质酸酶抑制剂中的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述腺苷七肽的氨基酸序列为MATGNAD。


3.一种透明质酸酶抑制剂，其特征在于：包含以质量百分数计90%的腺苷七肽。


4.如权利要求3所述透明质酸酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将约氏乳杆菌（CGMCC.NO19858）接种于50mLMRS肉汤培养基，培养11-12小时，再扩增于5LMRS肉汤培养基，继续培养10小时；
步骤2：将步骤1的5L约氏乳杆菌培养物接种于灭菌种子罐，加入50L种子培养基，5%NaOH调节pH=6.0～6.5，保持溶氧DO<10%，培养8～10小时，直至种子罐pH恒定不再下降；
步骤3：将种子罐发酵液泵如发酵罐中，加入500L发酵培养基，5%NaOH调节pH=6.0～6.5，保持溶氧DO<10%，并每隔4小时测定腺苷七肽的含量，培养10～12小时，直至发酵罐pH恒定不再下降，且腺苷七肽的含量达到4g/L，停止发酵；
步骤4：发酵液经过碟式离心机分离菌体和清液，分离因素12000G，进料压力0.1Mpa，清夜进入50nm陶瓷膜，通水量600～800L/m²•h-¹进一步分离，清液通过1500Da分子量超滤膜和300Da纳滤膜进行截留除杂，获得300～1500Da分子量的液体；
步骤5：将步骤4所获液体通过层析柱纯化分离，分离条件如下：A相：水，B相：乙腈，洗脱条件：0～50min：95%A,5%B；50～80min：85%A，15%B；80～180min：55%A...

【专利技术属性】
技术研发人员：张江，
申请(专利权)人：安杰利重庆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50