一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16‑1，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述广谱型多糖降解酶rAly16‑1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQID NO.1所示；密码子优化后的广谱型多糖降解酶rAly16‑1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQ ID NO.2，氨基酸序列与原氨基酸序列一致；广谱型多糖降解酶rAly16‑1是首次发现的属于PL‑8家族的褐藻胶裂解酶，该酶能够降解包括硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸皮肤素(HS/DS)、黄原胶、褐藻胶在内的多种酸性多糖，且以褐藻胶为最适底物。

【技术实现步骤摘要】
一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用，属于生物
技术背景生物质多糖(Polysaccharide)在自然界分布极广，几乎存在于所有生物体中[1]，如构成动植物细胞壁的肽聚糖和纤维素[2]；作为动植物储藏养分的糖原和淀粉；甲壳类动物外骨骼中的结构多糖几丁质[3]。研究表明，部分多糖及其系列寡糖具有抗凝血、抗氧化[4,5]、抗肿瘤[6,7]、抗病毒[8]、抗辐射等特殊的生物活性，参与分子识别、细胞信号转导与病毒侵染等生理过程[9,10]。多糖降解酶能催化多糖分子内糖苷键断裂并产生低聚合度的寡糖或单糖，是实现高效利用生物质多糖的关键，且用酶催化多糖实现寡糖制备的绿色生产方式具有较大的开发潜力[11]。随着生物质多糖结构的解析以及大量多糖降解酶的鉴定研究，通过蛋白质工程定制的专一性多糖降解酶分子可获得更高的催化效率、更优的稳定性，但对于复杂的多糖而言，专一性多糖降解酶分子仍具有非常有限的降解活性，使用单一酶难以完成生物质多糖的彻底降解。专一性多糖降解酶已有广泛研究，但仍属于基础研究，关于工具酶的改造、催化特性及应用特色系统分析较少。广谱型多糖降解酶是一类能降解多种多糖的降解酶[12,13]，能够实现“一酶多能”，目前少见报道，具有较大的开发运用潜力。褐藻胶是一种来源于褐藻的水溶性酸性多糖，是由α-1,4-L-古罗糖醛酸(α-1,4-L-guluronate，G)和β-1,4-D-甘露糖醛酸(β-1,4-D-mannuronate，M)组成的嵌段高聚物，长链分子中含有均聚(G)n段、均聚(M)n段及(GM)n自由杂聚段。褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶(PolysaccharideLyase,PL)，通过β消去反应催化糖苷键的断裂，从而生成含不饱和末端结构的低聚糖，并在232nm附近具有特征吸收[14]。多糖裂解酶系可归类为22个家族，依据对其初级结构疏水区域的分析，褐藻胶裂解酶归属于十二个家族，PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17、PL-18、PL-31、PL-32、PL-34、PL-36、PL-39，关于属于PL-8家族的褐藻胶裂解酶未见报道。目前，关于褐藻胶裂解酶的资源发掘、生化特征与分子改造等相关研究较多，但其中关于酶的底物选择性、底物降解模式与寡糖生成特性的研究较少，尤其大多数褐藻胶裂解酶仅见其对褐藻胶底物的降解报道[15,16]，几乎未见报道既能降解褐藻胶的同时又能降解其他多种多糖的广谱型多糖降解酶。整体上，未见关于具有M-专一性的广谱型褐藻胶内切酶的催化特性及相应机制的深入研究，因此缺少相关规律性的机制与认知，并给酶的精确运用及定向分子酶学改造带来困难。现有技术中，发现一个酶含有多功能模块，从而催化不同多糖底物生成寡糖的特性，但是这种发现仅限于中性多糖(如，琼脂糖、淀粉和卡拉胶等)，在酸性多糖中未见报道。本研究团队以上问题进行了深入研究，研究对象是分离自四川四姑娘山川贝母根系的放线菌(Streptomycessp.)CB16。前期的研究发现其能在14种不同多糖为唯一碳源的条件下生长[17]。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种链霉菌属来源的广谱型多糖降解酶rAly16-1及其编码基因与应用。本专利技术涉及的广谱型多糖降解酶rAly16-1是首次发现的属于PL-8家族的褐藻胶裂解酶，该酶能够降解包括硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸皮肤素(HS/DS)、黄原胶(Xanthan)、褐藻胶(Alginate)在内的多种酸性多糖，且以褐藻胶为最适底物。下面内容中Δ为不饱和单糖、X是指G或M；所述M为β-1,4-D-甘露糖醛酸，G为α-1,4-L-古罗糖醛酸。广谱型多糖降解酶rAly16-1简称“rAly16-1”本专利技术的技术方案如下：一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16-1，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。链霉菌(Streptomycessp.)CB16来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年4月11日，保藏编号CGMCCNo.12351。上述广谱型多糖降解酶rAly16-1，仅含有一个结构域，即归类与PL-8家族的GAG_Lyasesuperfamily。上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，所编码蛋白质含有809个氨基酸，分子量约为85.4kD。一种重组表达载体Ⅰ，包含上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870。一种重组菌Ⅰ，包含上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870。上述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870、重组表达载体Ⅰ、重组菌Ⅰ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1中的应用。一种密码子优化后的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQIDNO.2，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQIDNO.3所示。一种重组表达载体Ⅱ，包含上述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870。一种重组菌Ⅱ，包含上述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870。上述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870、重组表达载体Ⅱ、重组菌Ⅱ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1中的应用。上述广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解多糖中的应用。根据本专利技术优选的，所述多糖为酸性多糖。进一步优选的，所述酸性多糖为硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素E(CSE)、硫酸皮肤素(HS/DS)、透明质酸(HA)、黄原胶(Xanthan)、褐藻胶(Alginate)。更优选的，所述酸性多糖为褐藻胶(Alginate)。更优选的，所述酸性多糖为褐藻胶(Alginate)、高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶(PolyM)、高古洛糖醛酸嵌段褐藻胶(PolyG)、系列饱和甘露糖醛酸寡糖(M2-M8)、系列饱和古洛糖醛酸寡糖(G2-G8)、系列特征不饱和寡糖(UDP2-UDP8)。上述广谱型多糖降解酶rAly16-1在生产非还原端含有ΔM末端结构的不饱和寡糖、不饱和单糖中的应用。一种广谱型多糖降解酶rAly16-1突变酶，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQIDNO.3的第356位和/或第305位氨基酸。根据本专利技术优选的，所述突变酶，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQIDNO.3的第356位氨基酸由赖氨酸突变为亮氨酸。进一步优选的，所述突变酶的编码基因，根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16-1，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；/n优选的，所述的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQID NO.1所示；/n优选的，一种重组表达载体Ⅰ，其特征在于，包含所述的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870；/n优选的，一种重组菌Ⅰ，其特征在于，包含所述的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870。/n

【技术特征摘要】
20210406 CN 20211036809331.一种来源于链霉菌CB16菌株的广谱型多糖降解酶rAly16-1，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；
优选的，所述的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
优选的，一种重组表达载体Ⅰ，其特征在于，包含所述的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870；
优选的，一种重组菌Ⅰ，其特征在于，包含所述的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870。


2.权利要求1所述广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因orf03870、所述的重组表达载体Ⅰ、所述的重组菌Ⅰ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1中的应用。


3.一种密码子优化后的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870，核苷酸序列如SEQIDNO.2，氨基酸序列与原氨基酸序列一致，如SEQIDNO.3所示；
优选的，一种重组表达载体Ⅱ，其特征在于，包含所述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870；
优选的，一种重组菌Ⅱ，其特征在于，包含所述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870。


4.权利要求3所述密码子优化的广谱型多糖降解酶rAly16-1的编码基因YH03870、所述重组表达载体Ⅱ、所述重组菌Ⅱ在制备广谱型多糖降解酶rAly16-1中的应用。


5.权利要求1所述广谱型多糖降解酶rAly16-1在降解多糖中的应用；
优选的，所述多糖为酸性多糖；
优选的，所述酸性多糖为硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素E(CSE)、硫酸皮肤素(HS/DS)、透明质酸(HA)、黄原胶(Xanthan)、褐藻胶(Alginate)；
优选的，所述酸性多糖为褐藻胶(Alginate)；
优选的，所述酸性多糖为褐藻胶(Alginate)、高甘露糖醛酸嵌段褐藻胶、高古洛糖醛酸嵌段褐藻胶、系列饱和甘露糖醛酸寡糖、系列饱和古洛糖醛酸寡糖、系列...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文君，曾良欢，古静燕，李俊鸽，李新，卫洁，
申请(专利权)人：济南爱科替维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37