一种适于工业化的固定化天冬氨酸酶以及利用其生产L-天冬氨酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种一步纯化固定化方法来固定天冬氨酸酶，并利用其生产L‑天冬氨酸，该方法能够有效避免引入其他无关蛋白带来的安全风险，且不需要对酶进行纯化，相对传统固定化方法更节约，更有效，可显著提高单位酶活，显著缩短反应时间，提高生产效率，具有广阔的推广前景。

【技术实现步骤摘要】
一种适于工业化的固定化天冬氨酸酶以及利用其生产L-天冬氨酸的方法
本专利技术涉及酶固定化技术及氨基酸生产领域，具体涉及一种利用固定化天冬氨酸酶生产天冬氨酸的方法。
技术介绍
天门冬氨酸(Asparticacid),又称氨基丁二酸。L-天门冬氨酸是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一,可作为氨解毒剂、肝机能促进剂、疲劳恢复剂等医药品和添加剂用于各种清凉饮料的生产,还可作为生化试剂,培养基和有机合成中间体。L-天门冬氨酸与L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)合成的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)。由天门冬氨酸合成的天门冬氨酸钾镁盐(脉安定)可用于治疗心率失常、心动过速、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、肝炎和肝硬化等疾病,天门冬氨酸氨基氢的取代衍生物可以作为治疗神经类疾病和大脑疾病的药物,它的聚合物聚天门冬氨酸是目前正在大力推广的一种新型绿色阻垢剂和水处理剂。天门冬氨酸的生产主要包括化学法和生物催化法。化学法主要用于生产天门冬氨酸的外消旋体DL-天门冬氨酸。生物催化法包括游离细胞、固定化细胞及固定化酶法。目前工业上主要利用游离细胞或固定化细胞方法生产L-天冬氨酸，底物多为富马酸。固定化细胞生产L-天冬氨酸具有工艺简单、产量高、能够反复利用等优点。但由于细胞内还存在富马酸酶，可以催化富马酸生成苹果酸，生产过程中会产生苹果酸杂质，给天冬氨酸的提纯带来困难，因此这两种方法都需要对细胞进行筛选或基因工程改造。姜岷等2015年申请的专利“一种无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方法与应用”(专利号：CN105316273B)报道了一种无苹果酸副产品的大肠杆菌的构建办法。利用细胞催化生产L-天冬氨酸的另一个问题在于细胞中存在大量细菌蛋白，这些蛋白会不可避免地残留到L-天冬氨酸终产品中，给产品的后期应用，尤其是作为药品原料带来一定的风险。TETSUYATOSA等于1973年报道了利用固定化的天冬氨酸酶制备L-天冬氨酸的方法，不过其使用的菌体破碎后的粗酶制品，并未对天冬氨酸酶进行提纯，仍存在菌体蛋白残留带来的风险。这也是目前传统固定化酶生产工艺面临的共同问题。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术创新的采用了一步纯化固定化方法来固定天冬氨酸酶，并利用其生产L-天冬氨酸。本专利技术的方法能够有效避免引入其他无关蛋白带来的安全风险，且不需要对酶进行纯化，相对传统固定化方法更节约，更有效。另外，和传统菌体转化生产门冬氨酸生产工艺相比，本方法生产的固定化天冬氨酸酶可显著提高单位酶活，显著缩短反应时间，提高生产效率。本专利技术的一个方面，提供了一种如下的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将天冬氨酸酶基因与甲酰甘氨酸合成酶识别序列融合，所述甲酰甘氨酸合成酶识别序列包含醛基化标签并可被甲酰甘氨酸合成酶识别；(2)将步骤(1)获得的融合基因和甲酰甘氨酸合成酶基因分别连接到原核表达载体上；(3)将步骤(2)构建好的表达载体转入宿主细胞，对两种酶进行同步诱导表达；(4)离心收集诱导后的菌体，破碎，离心收集上清，与氨基载体混合进行固定化；(5)淋洗步骤(4)获得的固定化天冬氨酸酶，冷藏保存备用。在一种实施方案中，所述氨基载体优选为LX-1000EA、LX-1000HA、LX-1000NH或LX-1000EPHA。在一种实施方案中，所述天冬氨酸酶基因来源于大肠杆菌，所述甲酰甘氨酸合成酶基因来源于肺炎链球菌属。在一种实施方案中，所述天冬氨酸酶基因为大肠杆菌天冬氨酸酶基因的天然形式、基因重组形式或突变形式。在一种实施方案中，步骤(1)中所述醛基化标签为：5’CTGTGCACACCATCGCGG3’。在一种实施方案中，步骤(2)具体为：将步骤(1)融合后的基因连接到pET30a表达载体获得ASPase-30a表达载体，将甲酰甘氨酸合成酶基因利用Gateway系统，先连接到Topo载体，再重组至PDEST17表达载体上，获得FGE-pdest17表达载体。在一种实施方案中，步骤(3)具体为：将步骤(2)构建好的表达载体转入大肠杆菌，所述同步诱导表达的方法为：将大肠杆菌在含有氨苄霉素和卡那霉素的液体LB培养基中培养至OD600＝0.6-0.8时，加入IPTG或乳糖对两种酶进行诱导。优选地，诱导剂为IPTG时浓度为0.2～1mM，诱导剂为乳糖时浓度为0.1～1mM，诱导条件为4-37℃，2-24h。在一种实施方案中，步骤(4)中所述上清和氨基载体的质量比为20:1-1:1，反应温度4-30℃，pH6.5-9.0，反应时间2-24h。在一种实施方案中，步骤(5)中所述的淋洗液为H2O或或缓冲液。进一步的，本专利技术的另一个方面，还提供一种利用固定化天门冬氨酸酶生产L-天冬氨酸的方法，具体包括以下步骤：(1)配置50-250g/L富马酸溶液，氨水调pH；(2)加入利用上述改进的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法制备的固定化天门冬氨酸酶，搅拌，反应；(3)反应完成后，过滤固定化天门冬氨酸酶，重复利用；(4)转化液经加热，调节pH，冷却析晶，淋洗，烘干后得L-天冬氨酸成品。在一种实施方案中，步骤(1)中pH为7.5-9.0，反应液中加入1-2mM的Mg2+或Mn2+；在一种实施方案中，优选地，步骤(2)中固定化酶:富马酸比例为1:200-1:10，反应温度为30-40℃；在一种实施方案中，优选地，步骤(3)搅拌使用桨式或锚式搅拌，反应时间为0.5-24h，反应终点以富马酸含量小于2mg/ml计；固定化酶可反复使用20批以上。本专利技术的技术方案具有如下优点：1.和传统细胞法生产L-天冬氨酸工艺相比，本专利技术未增加工艺步骤；2.生产过程中未用到戊二醛等有机试剂，有效降低生产成本，并且有利于降低工业化过程对环境可能造成的污染；3.不需要对菌种进行基因敲除，节省了操作步骤，显著缩短反应时间，大大提高生产效率；4.转化液中引入的外源蛋白量明显减少，为后续L-天冬氨酸的纯化提供了有利条件，减少了外源蛋白残留带来的安全性风险。附图说明图1是本专利技术天冬氨酸酶固定化前后蛋白电泳图；其中，1：菌体破碎后沉淀；2：菌体破碎后上清；3：固定化后上清。图中箭头所示条带即为天冬氨酸酶。图2是本专利技术游离细胞和固定化酶转化液中E.coli.菌体蛋白残留水平图；图3是本专利技术固定化酶法转化和游离细胞转化速率对比图。具体实施方式为了更好的阐释本专利技术的目的、技术方案及优点，提供下述实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1基因获得和载体构建NCBI网站获得大肠杆菌天冬氨酸酶基因序列(ASPase基因，AccessionNo.NC_000913.3)和肺炎链球菌属甲酰甘氨酸合成酶基因序列(FGE基因，Ac本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)将天冬氨酸酶基因与甲酰甘氨酸合成酶识别序列融合，所述甲酰甘氨酸合成酶识别序列包含醛基化标签并可被甲酰甘氨酸合成酶识别；/n(2)将步骤(1)融合后的基因和甲酰甘氨酸合成酶基因分别连接到原核表达载体上；/n(3)将构建好的载体转入大肠杆菌，对两种酶进行同步诱导表达；/n(4)离心收集诱导完的菌体，破碎后离心收集上清，与氨基载体混合进行固定化。/n

【技术特征摘要】
1.一种一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将天冬氨酸酶基因与甲酰甘氨酸合成酶识别序列融合，所述甲酰甘氨酸合成酶识别序列包含醛基化标签并可被甲酰甘氨酸合成酶识别；
(2)将步骤(1)融合后的基因和甲酰甘氨酸合成酶基因分别连接到原核表达载体上；
(3)将构建好的载体转入大肠杆菌，对两种酶进行同步诱导表达；
(4)离心收集诱导完的菌体，破碎后离心收集上清，与氨基载体混合进行固定化。


2.如权利要求1所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：所述天冬氨酸酶基因为大肠杆菌天冬氨酸酶基因的天然形式、基因重组形式或突变形式；所述甲酰甘氨酸合成酶基因来源于肺炎链球菌属。


3.如权利要求1所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：步骤(1)中所述醛基化标签为：5’CTGTGCACACCATCGCGG3’。


4.如权利要求1所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：步骤(1)融合后的基因连接到pET30a载体获得ASPase-30a表达载体，甲酰甘氨酸合成酶基因利用Gateway系统，先连接到Topo载体，再重组至PDEST17载体上，获得FGE-pdest17载体。


5.如权利要求1所述的一步纯化固定化天冬氨酸酶的方法，其特征在于：步骤(3)中所述同步诱导表达的方法为：将转...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨辉，李港，马小涵，李何鸿晔，何瑞红，李燕飞，裴金玲，刘超，
申请(专利权)人：河北善泉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13