一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用，所述Cas12a变体包括如下中的至少一种：Lb2Cas12a‑K518R，氨基酸序列分别如SED ID NO.1所示；LbCas12a‑K538R，氨基酸序列分别如SED ID NO.2所示；AsCas12a‑K548R，氨基酸序列分别如SED ID NO.3所示。本发明专利技术首次通过蛋白改造，获得Cas12a变体，使Cas12a的PAM识别相比较对应野生型更严格，从而降低脱靶效应；所述三种Cas12a变体能够在crRNA的介导下定点对真核生物基因组进行基因编辑且具有更低的脱靶效应，三种Cas12a变体的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类。

【技术实现步骤摘要】
一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用
本专利技术涉及基因编辑
，特别涉及一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用。
技术介绍
自2013年以来，基因编辑技术取得了突破性进展，此项技术已经在基础科学研究、医药、临床、生物技术等许多领域引起了新的变革。除了具有代表性的Cas9系统之外，Cas12，又名Cpf1，作为又一种被发现的具有基因编辑效应的CRISPR系统新成员，极大的扩大了基因编辑系统靶点的可编辑范围，相比于Cas9系统，Cas12a所具有的加工前提RNA的功能，为其介导多基因编辑提供了相比与Cas9系统更为便捷高效的编辑能力。除此之外，相比于Cas9的向导RNA，Cas12a的向导RNA组成更为简单，设计更为方便。2015年，张峰团队首次发现了Cas9系统之外的另外一种具有基因编辑能力的新成员，Cas12a，又名Cpf1，将其划分到CRISPR系统2类V型中。相比于Cas9系统，Cas12a的编辑效率与Cas9的效率相当，在有些靶点低于Cas9。Cas12a的脱靶率极低，相比于Cas9脱靶率高的特性，Cas12a是一种安全的基因编辑工具。Cas12a在切割之后形成粘性末端，而Cas9形成平末端，已有研究表明，Cas12a切割之后的粘性末端相比于Cas9的平末端而言，更容易发生同源重组修复，这也为基因的定点插入和修复提供了更好的工具。在向导RNA的加工方面，Cas12a具有明显的优势，仅仅只需要Cas12a本身就能够完成对前提RNA的加工，而Cas9系统则需要RNaseIII的加工，这极大地促进Cas12a在多基因编辑上的应用。在PAM的识别上，Cas12a识别5’-TTTN-3’或5’-KYTV-3’，Cas9则识别5’-NGG-3’。因此，Cas12a作为一种新型基因编辑工具，与Cas9系统一道，为科学研究和疾病的治疗提供了有力的工具。基于对目前已有的Cas12a的研究，为应对将来各种情况下的基因编辑事件，发现更多的具有一定特性的Cas12a变体是一件具有重要意义的事情。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用，该Cas12a变体包括Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R，AsCas12a-K548R，其在体外比对应野生型PAM识别更严格；且在体内脱靶效应更低。在本专利技术的第一方面，提供了一种Cas12a变体，所述Cas12a变体包括如下中的至少一种：Lb2Cas12a-K518R，氨基酸序列分别如SEDIDNO.1所示；LbCas12a-K538R，氨基酸序列分别如SEDIDNO.2所示；AsCas12a-K548R，氨基酸序列分别如SEDIDNO.3所示。在本专利技术的第二方面，提供了一种重组表达载体，所述重组载体表达所述的Cas12a变体。进一步地，所述重组表达载体包括质粒载体、病毒载体和噬菌体载体中的一种。在本专利技术的第三方面，提供了一种重组菌或重组细胞系或重组病毒，包含所述的重组表达载体。在本专利技术的第四方面，提供了一种重组病毒，所述重组病毒采用所述的病毒载体包装获得，所述重组病毒包括表达所述的Cas12a变体的腺病毒或慢病毒。在本专利技术的第五方面，提供了一种所述的Cas12a变体、所述的重组表达载体、所述的重组菌或重组细胞系和所述的重组病毒在基因编辑中的应用。在本专利技术的第六方面，提供了一种包括所述Cas12a变体的CRISPR/Cas12a基因编辑系统。在本专利技术的第七方面，提供了所述系统还包括：靶向目标基因的crRNA或crDNA。在本专利技术的第八方面，提供了一种对受体中的目的基因进行基因编辑的方法，借助CRISPR/Cas12a系统对受体中的目的基因进行基因编辑，所述方法包括：通过将所述的重组表达载体导入受体提供Cas12a变体；通过靶向目标基因的crRNA或crDNA质粒导入受体提供crRNA；所述Cas12a变体和所述crRNA在受体中形成复合物识别目的基因并完成编辑。进一步地，所述受体包括293T细胞、ATDC5细胞和C6细胞中的一种。本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：本专利技术提供的一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用，本专利技术首次通过蛋白改造，获得Cas12a变体包括Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R，AsCas12a-K548R，使Cas12a的PAM识别相比较对应野生型更严格，从而降低脱靶效应；所述三种Cas12a变体能够在crRNA的介导下定点对真核生物基因组进行基因编辑且具有更低的脱靶效应，三种Cas12a变体的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1为应用例1中Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R，AsCas12a-K548R在基因编辑中的应用的结果；其中，A代表野生型Lb，B代表LbK538R，C代表野生型Lb2，D代表Lb2K518R，E代表野生型As，F代表AsK548R；图2为应用例2中二代测序分析原理图；图3为应用例2中Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R在体外比对应野生型PAM识别更严格的结果；图4为应用例3中Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R，AsCas12a-K548R在体内脱靶效应更低的结果；图5为应用例3中Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R，AsCas12a-K548R在体内脱靶效应更低的结果。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本专利技术，本专利技术的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。除非另有特别说明，本专利技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。本专利技术技术方案的总体思路如下：本申请专利技术人通过实验发现：对野生型Cas12a进行如下改造：Lb2Cas12a-K518R，氨基酸序列分别如SEDIDNO.1所示；具体改造为：第518位氨基酸K突变为氨基酸R，LbCas12a-K538R，氨基酸序列分别如SEDIDNO.2所示；具体改造为：第538位氨基酸K突本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Cas12a变体，其特征在于，所述Cas12a变体包括如下中的至少一种：/nLb2Cas12a-K518R，氨基酸序列分别如SED ID NO.1所示；/nLbCas12a-K538R，氨基酸序列分别如SED ID NO.2所示；/nAsCas12a-K548R，氨基酸序列分别如SED ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种Cas12a变体，其特征在于，所述Cas12a变体包括如下中的至少一种：
Lb2Cas12a-K518R，氨基酸序列分别如SEDIDNO.1所示；
LbCas12a-K538R，氨基酸序列分别如SEDIDNO.2所示；
AsCas12a-K548R，氨基酸序列分别如SEDIDNO.3所示。


2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组载体表达权利要求1所述的Cas12a变体。


3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括质粒载体、病毒载体和噬菌体载体中的一种。


4.一种重组菌或重组细胞系或重组病毒，其特征在于，包含权利要求2所述的重组表达载体。


5.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒采用权利要求3所述的病毒载体包装获得，所述重组病毒包括表达权利要求1所述的Cas12a变体的腺病毒或慢病毒。


6.一种权利要求1所述的Cas12a变体、权利要求2-3任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷雷，周进，陈鹏，王宏建，刘欢，方嘉凌，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42