一种脂肪组织保护液及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种脂肪组织保护液，所述脂肪组织保护液由人血白蛋白注射液、丙酮酸钠、生理盐水、青霉素、链霉素组成。同时还提供了该保护液在保存脂肪组织以及分离制备脂肪源干细胞中的应用。采用本发明专利技术保护液制备得到的脂肪源干细胞数量大、活率高、纯度高，安全性的得到保证，能满足临床要求。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪组织保护液及其应用
本专利技术涉及一种细胞的分离方法，尤其涉及一种脂肪源干细胞的分离制备方法。
技术介绍
脂肪源干细胞(adiposederivedstemcells,ADSC)具有自我更新与多种分化潜能,通过分离培养可以在体外稳定增殖,在特定的诱导条件下,可以被分化诱导为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等。新鲜分离的ADSC在组织工程、再生医学及修复中有着广泛的应用，如应用于股骨头坏死组织工程技术修复、辅助脂肪移植、面部年轻化、促进毛发生长、皮肤烧伤、糖尿病足、骨缺损修复、神经损伤修复以及炎症性疾病等的治疗。新鲜分离的ADSC是来源于脂肪组织的脂肪血管基质细胞(脂肪血管基质组分，Stromalvascularfraction，SVF)的主要组成部分之一(Adiposetissue-derivedstromalvascularfractioninregenerativemedicine:abriefreviewonbiologyandtranslation.StemCellResTher.201715；8(1):145.)。2018年复旦大学汤其群教授将从脂肪组织中分离的SVF作为ADSC的一种。ClinicalTrials.gov网站上登记的众多相关临床研究中，有很多研究者直接使用新鲜分离的ADSC进行临床研究。CD34作为间充质干细胞的主要阴性标记，研究发现在新鲜分离的ADSC中可以检测到CD34，而且会随着不断的传代而逐渐消失，Adiposetissue-derivedstromalvascularfractioninregenerativemedicine:abriefreviewonbiologyandtranslation.(StemCellResTher.201715；8(1):145.)一文CD34可作为新鲜分离的ADSC纯度的评价指标之一，且有众多其他研究学者将CD34视为前脂肪细胞和祖细胞的标志物，以CD34的检测结果来判断新鲜分离的ADSC纯度。从脂肪中分离ADSC的方法尚未达成共识，而且纯度不高，目前ADSC的制备方法主要有两种：一是使用蛋白酶水解消化脂肪组织的酶消化法；二是不使用蛋白水解酶的物理机械法，如常鹏于2014年8月12申请的授权号为CN203999585U的专利“一种富集脂肪源干细胞自动提取装置”公开了一种自动提取装置分离富集脂肪源干细胞的方法，使用物理机械法分离脂肪源干细胞耗时很长，有些方法需要三天左右，同时细胞得率、活性以及纯度较低，很难满足临床需求。。酶消化法常采用Ⅰ型胶原酶或混合胶原酶与脂肪组织按一定比例混合，消化1～3小时，随后离心过滤得到脂肪源干细胞，细胞得率、活性和物理机械法相比虽然有一定程度的提高，但是仍有较大的改进和提升空间。申请公布号为CN104560868A的专利技术专利“一种脂肪干细胞的原代分离培养方法”，公开了一种使用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体分离脂肪干细胞的方法，每毫升脂肪分离的细胞量为3.79×106，该方法使用了来源于动物的胰蛋白酶，用于临床时增加感染的风险。申请号为CN110241078A的专利技术专利“一种脂肪干细胞的提取和注射方法”，公布了一种将脂肪组织破碎后使用Ⅰ和Ⅱ胶原酶混合液消化分离脂肪干细胞的方法，该方法细胞得率低，50mL脂肪分离的细胞总量为2.13～2.21×106，且活率低于80％。申请公布号为CN109652367的专利技术专利“一种制备临床级脂肪干细胞的方法”，公布了将脂肪组织机械破碎后使用Ⅰ型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ和胰蛋白酶混合液消化分离脂肪干细胞的方法，该方法分离过程中引入大量外源物质，1mL脂肪分离的细胞量仅有0.6～0.8×106，且活率低于90％。申请公布号为N107475190A的专利技术专利“一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途”，公开了一种脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，所得细胞中单核细胞含量较低仅有17％～30％，采用CD34进行纯度分析的结果可知纯度达不到60％。申请公布号为CN110129260A的专利技术专利“一种脂肪组织中的血管基质成分的提取方法及应用”，公开了一种采用0.2％的胶原酶进行低温酶解的方法处理脂肪组织，从而提高细胞的得率，该方法虽然得率高，但消化时间长达3小时，而且CD34+细胞的比例低，仅为32.82％，限制了其在临床上的应用。综上所述，新鲜分离的ADSC应用范围广，且分离方法不完善，主要问题有：(1)安全性未得到保证，使用的消化酶为非临床级或有动物源性物质引入，增加感染风险；(2)ADSC得率低；(3)制备的ADSC中单核细胞含量少、纯度低。这些问题限制了ADSC临床应用，影响临床使用效果。因此需要开发出一种安全的、高效的、可制备高得率、高活率和高纯度ADSC的方法。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是提供一种脂肪组织保护液，用于保存脂肪组织，然后可通过使用该保护液保存脂肪组织，分离获得大量高纯度的优质临床级ADSC，提高分离效率和ADSC的活率和数量。本专利技术提供一种脂肪组织保护液，所述脂肪组织保护液由人血白蛋白注射液、丙酮酸钠、生理盐水、青霉素、链霉素组成。上述人血白蛋白注射液和生理盐水的体积比为5～10:90～95。上述丙酮酸钠浓度为1～3mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL。上述丙酮酸钠浓度为2mg/mL.本专利技术第二方面还提供上述脂肪组织保护液的应用，所述脂肪组织保护液用于保存脂肪组织。本专利技术第三方面，还提供上述脂肪组织保护液用于分离制备脂肪源干细胞。本专利技术的突出优点：1.在保护液中加入人血白蛋白为组织代谢提供氮源、维持细胞渗透压；2.保护液中加入丙酮酸钠，为组织代谢提供碳源、同时具有抗氧化作用，维持细胞活性，减少细胞的凋亡；3.ADSC活性高、数量大，1mL脂肪组织可分离1.27～5.16*106的ADSC，是现有方法的20倍左右，ADSC活率＞90％；4.本专利技术提供的保护液大幅度提高了ADSC的活率和纯度，分离ADSC中单核细胞量为32.8％～65.49％，是现有技术的2倍左右，以检测细胞表面的CD34含量判断ADSC的纯度，ADSC纯度为51.01％～90.73％，是现有技术的1～3倍。本专利技术因分离的SVF中大部分为ADSC，因此将分离的细胞统称为ADSC。本专利技术共采集20批数据，在具体实施例中包括以下步骤：步骤一：对供者身体健康状况进行检查，供者身体状态良好，无遗传病家族病史、无恶性肿瘤、自身免疫性疾病、急慢性传染病、先天性疾病、无血液系统疾病和无其他影响手术抽脂疾病史。人源性特定病毒(HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)为阴性、梅毒螺旋体阴性，如果供者的相关检查结果为阳性，需在独立的操作空间和空调系统下完成，避免交叉污染的发生；步骤二：配制脂肪组织保护液，脂肪组织保护液含人血白蛋白注射液、丙酮酸钠(原料药)、生理盐水、青霉素(注射用)、链霉素(注射用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪组织保护液，其特征在于，所述脂肪组织保护液由人血白蛋白注射液、丙酮酸钠、生理盐水、青霉素、链霉素组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂肪组织保护液，其特征在于，所述脂肪组织保护液由人血白蛋白注射液、丙酮酸钠、生理盐水、青霉素、链霉素组成。


2.如权利要求1所述脂肪组织保护液，其特征在于，所述人血白蛋白注射液和生理盐水的体积比为5～10:90～95。


3.如权利要求2所述脂肪组织保护液，其特征在于，所述丙酮酸钠浓度为1～3mg/mL，青霉素和链霉素的浓度为100Units/mL。


4.如权利要求3所述脂肪...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，潘程娇，王逸飞，梅增健，王春慧，李宁，袁惟芯，
申请(专利权)人：上海赛傲生物技术有限公司，北京赛傲生物技术有限公司，重庆国联干细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31