一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，包括进行hUC‑MSCs的分离、hUC‑MSCs的体外扩增、收集P3代细胞进行降温冻存、hUC‑MSCs复苏后与新鲜细胞进行比较统计和hUC‑MSCs的检测及鉴定。本发明专利技术的有益效果是：使用无血清培养贴壁法获得大量且纯度较高的MSCs，使用程序降温仪进行程序降温，降低对细胞的伤害，且保持较好的细胞活力，且得出冻存液比例为DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5时，冻存后活率最佳，复苏后形态及生长速率与正常新鲜细胞培养基本一致。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法
本专利技术涉及一种细胞活性研究方法，具体为一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，属于医学

技术介绍
间充质干细胞，MSC是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，人脐带间充质干细胞已成为细胞治疗的重要候选种子细胞,特别在各种退行性疾病和自身免疫性疾病的组织修复和免疫调节方面有良好的应用前景。但过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，而且临床上细胞移植的供体和受体往往存在不同时性，很难保证即离即用，且充足的数量需求保证也会是一个问题，因此，本申请提出一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，包括以下步骤：步骤A：进行hUC-MSCs的分离，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm3的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中，对hUC-MSCs进行分离；步骤B：hUC-MSCs的体外扩增，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作，轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×103/cm2的接种密度进行传代；步骤C：收集P3代细胞进行降温冻存，将收集的细胞用程序降温仪进行降温冻存，并根据冷冻液浓度不同将其分为五组；步骤D：hUC-MSCs复苏后与新鲜细胞进行比较统计，冻存10个月后将细胞置于37℃恒温水浴箱中快速复苏，融化后迅速移入离心管中，加入无血清培养基进行复苏，吹吸混匀，离心弃去上清液后用台盼蓝溶液计数计算活率；步骤E：hUC-MSCs的检测及鉴定，五组hUC-MSCs复苏后进行培养，并对各组复苏后进行形态学观察。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤A中，在初次培养时，6天后培养液全量换液一次，镜下观察是否有细胞从组织块周围爬出，以后每3天换液一次，直至可见细胞爬出且密度达70-80%,可以考虑进行传代操作。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤C和D中，细胞冷冻保存时，细胞降温、复温过程中必须经过-15℃～-60℃这一温度区间，而该温度区间对细胞具有一定的伤害性，选择程序降温仪进行程序降温。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤C中，根据冻存液不同分为五组，DMSO:FBS=1：9、DMSO:FBS:DMEM=1：8.5：0.5，DMSO:FBS:DMEM=1：8：1、DMSO:FBS:DMEM=1：7：2，收集P3代细胞进行程序降温冻存。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤E中，用MTT法比较细胞生长情况，加入无血清培养基进行培养，取复苏后对数生长期细胞，消化成细胞悬液，以P3代未冻存细胞悬液为对照组，调整细胞密度，按每孔1*10^4接种96孔板，去除培养基，加入20微升MTT溶液，采用酶标仪分别测定5组及对照组细胞的吸光度，流式细胞仪检测细胞周期，流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105抗原。本专利技术的有益效果是：该间充质干细胞冻存液及其活性研究方法设计合理，步骤A中，在初次培养时，6天后培养液全量换液一次，镜下观察是否有细胞从组织块周围爬出，以后每3天换液一次，直至可见细胞爬出且密度达70-80%,可以考虑进行传代操作，确保实验研究用细胞的活性，减少实验数据的误差，保证分离的彻底性且方便传代操作的稳定进行，步骤C和D中，细胞冷冻保存时，细胞降温、复温过程中必须经过-15℃～-60℃这一温度区间，而该温度区间对细胞具有一定的伤害性，选择程序降温仪进行程序降温，降低在-15℃～-60℃这一温度区间对细胞的伤害，减少实验误差，提高细胞存活率的精准度，步骤C中，根据冻存液不同分为五组，DMSO:FBS=1：9、DMSO:FBS:DMEM=1：8.5：0.5，DMSO:FBS:DMEM=1：8：1、DMSO:FBS:DMEM=1：7：2，收集P3代细胞进行程序降温冻存，方便根据对比试验得出更加精准的实验数据，从而确定最佳冻存液浓度，步骤E中，用MTT法比较细胞生长情况，加入无血清培养基进行培养，取复苏后对数生长期细胞，消化成细胞悬液，以P3代未冻存细胞悬液为对照组，调整细胞密度，按每孔1*10^4接种96孔板，去除培养基，加入20微升MTT溶液，采用酶标仪分别测定5组及对照组细胞的吸光度，流式细胞仪检测细胞周期，流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105抗原，根据五组细胞的生长情况以及复苏后形态进行对比统计，得出冻存液比例为DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5时，冻存后活率最佳，复苏后形态及生长速率与正常新鲜细胞培养基本一致。附图说明图1为本专利技术结构示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，包括以下步骤：步骤A：进行hUC-MSCs的分离，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm3的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中，对hUC-MSCs进行分离；步骤B：hUC-MSCs的体外扩增，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作，轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×103/cm2的接种密度进行传代；步骤C：收集P3代细胞进行降温冻存，将收集的细胞用程序降温仪进行降温冻存，并根据冷冻液浓度不同将其分为五组；步骤D：hUC-MSCs复苏后与新鲜细胞进行比较统计本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤A：进行hUC-MSCs的分离，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤A：进行hUC-MSCs的分离，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm3的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中，对hUC-MSCs进行分离；
步骤B：hUC-MSCs的体外扩增，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作，轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×103/cm2的接种密度进行传代；
步骤C：收集P3代细胞进行降温冻存，将收集的细胞用程序降温仪进行降温冻存，并根据冷冻液浓度不同将其分为五组；
步骤D：hUC-MSCs复苏后与新鲜细胞进行比较统计，冻存10个月后将细胞置于37℃恒温水浴箱中快速复苏，融化后迅速移入离心管中，加入无血清培养基进行复苏，吹吸混匀，离心弃去上清液后用台盼蓝溶液计数计算活率；
步骤E：hUC-MSCs的检测及鉴定，五组hUC-MSCs复苏后进行培养，并对各组复苏后进行形态学观察。


2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小龙，李雯雯，石珂，王彦，
申请(专利权)人：河南省银丰生物工程技术有限公司，银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41