人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法技术

本发明专利技术涉及干细胞技术领域，更具体的，是一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法。包括对人脐带间充质干细胞冻存方法、复苏方法，以及跟踪记录平台，通过冻存及复苏实现对脐带间充质干细胞的保存，从采集到运输、从检测到培养、从冻存到复苏的各个过程中，对每一个过程都就行严格的质量监控，并形成环环相扣的、唯一对应的记录，确保干细胞样本的唯一性和可追溯性。也可为研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，建立人脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据的重要基础。

【技术实现步骤摘要】
人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法
本专利技术涉及干细胞
，更具体的，是一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。脐带间充质干细胞能具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；能促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果；能修复损伤或病变的组织器官，用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％.15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。细胞复苏是与细胞冻存相反的过程，即是细胞恢复生长的过程，是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养。当恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，通过冻存及复苏实现对脐带间充质干细胞的保存，本申请从采集到运输、从检测到培养、从冻存到复苏的各个过程中，对每一个过程都就行严格的质量监控，并形成环环相扣的、唯一对应的记录，确保干细胞样本的唯一性和可追溯性。也可为研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，建立人脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据的重要基础。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其冻存方法，包括步骤：D1细胞室及工作台紫外线照射20～30min；培养液、冻存液、9％氯化钠注射液、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱40℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天换液；配制含10％DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液；准备9％氯化钠注射液、胰蛋白酶、DMSO；D2取预冻存细胞，去除旧培养液，用9％氯化钠注射液清洗；D3去除9％氯化钠注射液，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；D4加入培养基终止消化，吹打使细胞悬浮，转移至离心管中，取样计数，离心，1200rpm，10min；D5去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；D6将细胞分装入冻存管中，每管1～2.5ml；D7控制冷冻速度，保存标准时，将其冻存管移入液氮容器内保存；D8在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。进一步的，D7步骤中将装有细胞的冻存管放入4℃药品保存箱预冷10-30min，程序降温盒中，在低温样本转移车的保护下，转移至-80℃超低温药品保存箱，保存4-72小时，转移至气相液氮储存罐；或，D7步骤中将装有细胞的冻存管放入4℃药品保存箱预冷10-30min，放入-20℃药品保存箱0.5-1h，然后放入-70℃药品保存箱中8-16h，取出冻存管，移入液氮容器内；或，D7步骤中冻存温度控制方式为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，转移至气相液氮储存罐。进一步的，D2步骤中预冻存细胞可为从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞，优选对数生长期细胞。进一步的，细胞在冻存前24小时内更换一次培养液。进一步的，其复苏方法，包括步骤：S1从液氮容器中取出冻存管，直接浸入40℃恒温水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化；S2从40℃恒温水浴锅中取出冻存管，迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒并晾干；S3用吸管吸出细胞悬液，加4℃预冷的氯化钠注射液，重悬混匀；S4离心，1200rpm，8min；S5弃去上清液，把细胞转入含有10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度；S6接种培养瓶，然后把培养瓶移至培养箱，36℃～38℃培养72h±24h；S7更换新鲜培养基，增殖至所需数量，收获细胞；S8详细记录复苏细胞的名称、数量、复苏时间、存放部位。进一步的，在步骤S1中，解冻冻存管过程中盖上恒温水浴锅的盖；40℃恒温水浴锅中融化，冻存管细胞融化时间为1-3min，融化后移出40℃水浴。进一步的，步骤S3中用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀在4℃生物安全柜中进行操作。进一步的，还包括跟踪记录平台，该跟踪记录平台包括细胞采集单元、运输跟踪单元、检测跟踪单元、冻存单元、复苏单元、质控单元；细胞采集单元，用以记录采集人脐带间充质干细胞信息，对采集信息形成唯一编码标识；运输跟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，其冻存方法，包括步骤：/nD1细胞室及工作台紫外线照射20～30min；培养液、冻存液、9％氯化钠注射液、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱40℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天换液；/n配制含10％DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液；准备9％氯化钠注射液、胰蛋白酶、DMSO；/nD2取预冻存细胞，去除旧培养液，用9％氯化钠注射液清洗；/nD3去除9％氯化钠注射液，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；/nD4加入培养基终止消化，吹打使细胞悬浮，转移至离心管中，取样计数，离心，1200rpm，10min；/nD5去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；/nD6将细胞分装入冻存管中，每管1～2.5ml；/nD7控制冷冻速度，保存标准时，将其冻存管移入液氮容器内保存；/nD8在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。/n

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，其冻存方法，包括步骤：
D1细胞室及工作台紫外线照射20～30min；培养液、冻存液、9％氯化钠注射液、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱40℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天换液；
配制含10％DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液；准备9％氯化钠注射液、胰蛋白酶、DMSO；
D2取预冻存细胞，去除旧培养液，用9％氯化钠注射液清洗；
D3去除9％氯化钠注射液，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；
D4加入培养基终止消化，吹打使细胞悬浮，转移至离心管中，取样计数，离心，1200rpm，10min；
D5去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
D6将细胞分装入冻存管中，每管1～2.5ml；
D7控制冷冻速度，保存标准时，将其冻存管移入液氮容器内保存；
D8在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。


2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，D7步骤中将装有细胞的冻存管放入4℃药品保存箱预冷10-30min，程序降温盒中，在低温样本转移车的保护下，转移至-80℃超低温药品保存箱，保存4-72小时，转移至气相液氮储存罐；或，
D7步骤中将装有细胞的冻存管放入4℃药品保存箱预冷10-30min，放入-20℃药品保存箱0.5-1h，然后放入-70℃药品保存箱中8-16h，取出冻存管，移入液氮容器内；或，
D7步骤中冻存温度控制方式为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，转移至气相液氮储存罐。


3.根据权利要求2所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，D2步骤中预冻存细胞可为从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞，优选对数生长期细胞。


4.根据权利要求3所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，细胞在冻存前24小时内更换一次培养液。


5.根据权利要求2中任一项所述的一种人脐带间充质干细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，其复苏方法，包括步骤：
S1从液氮容器中取出冻存管，直接浸入40℃恒温水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化；
S2从40℃恒温水浴锅中取出冻存管，迅速用酒精棉球擦...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷彦辉，胡隽源，杨焱培，李宣宁，
申请(专利权)人：河北北科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13