一种干细胞质量评估体系及应用方法技术

本发明专利技术涉及脐带干细胞质量评估技术领域，更具体的，是一种干细胞质量评估体系及应用方法。在干细胞培养的过程中，经对不同阶段的培养组织采集样本，并进行检测，以分析干细胞质量；对干细胞分离阶段、干细胞培养组织、干细胞扩增阶段、干细胞收获阶段、产品放行阶段采集样本，进行检测。发明专利技术的目的在于提供一种干细胞质量评估体系及应用方法,根据干细胞的培养的不同阶段进行相应的检测，以其不同阶段的检测结果作为下一步骤是否可以继续使用的标准，并应用该体系为干细胞培养过程的有效控制和数据的溯源提供依据。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞质量评估体系及应用方法
本专利技术涉及干细胞质量评估
，更具体的，是一种干细胞质量评估体系及应用方法。
技术介绍
干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。1976年，Freidenstein等首次发现在骨髓里存在一群非造血的骨髓基质细胞，呈克隆性贴壁生长，形态和成纤维细胞相似。最初被定义为成纤维细胞集落形成单位，之后更名为间充质干/基质细胞(MesenchymalStem/Stromalcell，MSCs)。如今，MSCs已从人类许多其他来源组织中分离和检测出来，广泛分布于几乎所有组织(包括胎儿和成人)，例如骨髓、血液、脐带、脐血、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤、经血等等。随着干细胞研究的发展，干细胞已经被视为是预防医学的先趋，再加上近年来相关产业也加速成长，突显人们对于干细胞在医疗应用上的需求。由于干细胞负责体内细胞的修复和更新，所以干细胞具有维持身体器官与组织健康的功能。因此，干细胞可以视为是维持整体健康的决定性因素，并通过干细胞开启审视健康的新窗口。选择合适的MSCs制备工艺，主要取决于两点：一是细胞剂量的要求，二是自体还是异体使用。目前，间充质干细胞制备技术分为两大类，包括平皿制造工艺和生物反应器制造工艺。利用自体细胞来源的MSCs进行个体化治疗，属于小规模生产，各自企业的标准和工艺也不尽相同。异体细胞来源的MSCs规模化制造工艺是利用生物反应器，模拟其在体内的生长发育环境，进行高效率增殖。同时，可以满足自动化、量产并能保证细胞的高活率和高质量的要求，这也是今后各种干细胞规模化生产的发展趋势。中小规模的临床试验通常使用平皿制造工艺，包括多层平皿培养体系，也称“细胞工厂”(大约8-10层平皿，主要有赛默飞、BD，Millipore等品牌)，可以扩增出100亿(10*10)个细胞，相对经济有效。在OsirisTherapeutics公司进行的早期临床试验中就声称，只需一份捐献的骨髓，便可制备多达10000份患者的剂量，用于治疗GVHD。他们的细胞制备，使用平皿制造工艺。从成本上来看，平皿制备工艺比较经济。但是质控比较麻烦，需要的人工也多，同时也容易引入外来操作风险。比起人工手动操作，自动化平皿制造工艺略有进步，也具有在线监控功能，可以实现封闭式培养。例如，XpansionMultiplate便是自动化平皿培养的一种设备，由一堆平板(10-200层)组成，具有可扩展性。据制造商声称，这种200块平板组成的系统一次开机，可生产200亿(2X10*10)个细胞，但生产下游不好处理。如果剂量处于100-1000亿(1-10X10*10)个细胞之间，平皿制备工艺可以满足MSCs的生产需求，但通常需要堆叠40层。这就需要更大的空间和自动处理装置。平皿制备工艺，无法满足规模化的细胞生产需求(大于300亿，即3X10*10细胞)，这时候就需要引进新的工艺体系。比如，下面要介绍的生物反应器制备体系。生物反应器制备工艺，可作为体外培养的平皿制备工艺替代品。生物反应器，通常对细胞最小接种量是有要求的。早期的MSCs扩增，通常先是在平皿中手工操作进行，随后再被接种到生物反应器中。简单的搅拌容器，比平皿更有优势，不但具有可扩展性，还可以提供均匀的最低浓度梯度(pH，溶解氧，代谢物)。如果细胞与微载体结合培养时，可在搅拌条件下固定并培养贴壁细胞，这无疑是最有效技术之一。两大类生物反应器类型：灌注式生物反应器(包含中空纤维生物反应器)与搅拌悬浮式生物反应器。灌注式生物反应器，是一种将MSCs附着在固定基质上的系统(如微珠)，可连续交换介质，在排出介质的同时引入新鲜介质。灌注生物反应器由几组平行板、中空纤维、固定床和流化床生物反应器组成。灌注式生物反应器为细胞生长提供了一个连续的表面积，MSCs可单层附着在填充床表面上，但必须在低流速下灌注(通常不超过3X10-4m/s)，使细胞剪切力最小，但这也会导致向细胞输送的氧气减少。通过解耦营养和氧灌注的策略，可以限制培养基的流动而不影响氧向细胞的扩散。一般而言，填充床反应器的细胞获得率通常相对较低(18％)，产量限制在约1亿(10*8)个细胞。中空纤维生物反应器，也属于灌注式生物反应器的一种。它由一个容器和堆叠的半透性中空纤维组成，可以允许细胞生长在中空纤维毛细管的一个表面，而营养液和氧气在另一个表面流动。其扩增效率大约是平皿制备体系的10倍(按照培养UC-MSCs计算)。中空纤维生物反应器，每一次运行可生产4～6亿(10^8)数量的MSCs，具有典型的商业特性。如果要开展临床试验需要供应足够的MSCs，那么则需要多个生物反应器才能实现。因此，灌注式生物反应器配置更适合于自体的规模化生产，而不是异体细胞的规模化生产。搅拌悬浮式生物反应器，主要用于MSCs的大规模生产。以旋转瓶为原型，用搅拌臂将培养基在培养瓶中搅拌混匀。在搅拌悬浮式生物反应器中，MSCs通常附着在悬浮在搅拌容器中的微载体上。这类生物反应器可以产生多达5000亿(50X10*10)个细胞(此类产品有Eppendorf、ThermoScientific和PALL等品牌，国内华龛生物自主研发的3DFlovivaSpin系列也属于此类)。其范围从小体量(3-250ml，适合工艺参数测试)到台式规模(1.5-5L)，再到中式规模(50-300L)，最后到生产规模(500-2000L)。工艺下游的处理需要连续离心，自动袋或小瓶填充等完成。近年来，干细胞临床转化应用发展趋势很快，与细胞治疗相关的临床实验注册数目呈现指数型增长。作为细胞治疗的重要组成部分，干细胞在器官修复和组织再生中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。无论采用何种形式的干细胞培养和应用，都需要对干细胞的质量做系统的评估，形成稳定、成熟、有效的干细胞质量评估体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种干细胞质量评估体系及应用方法,根据干细胞的培养的不同阶段进行相应的检测，以其不同阶段的检测结果作为下一步骤是否可以继续使用的标准，并应用该体系为干细胞培养过程的有效控制和数据的溯源提供依据。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种干细胞质量评估体系，在干细胞培养的过程中，经对不同阶段的培养组织采集样本，并进行检测，以分析干细胞质量；其特征在于，S1，对干细胞培养组织采集样本，进行样本来源登记、供体筛查和外观观察、无菌检测，合格后赋予唯一识别码，然后进入分离制备阶段；S2，使用经S1步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞分离阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测；S3，使用经S2步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞扩增阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测；S4，使用经S3步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞收获阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测、细胞纯度检测；S5，使用经S4步骤检测合格的干细胞培养组织培养，产品放行阶段采集样本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞质量评估体系，在干细胞培养的过程中，经对不同阶段的培养组织采集样本，并进行检测，以分析干细胞质量；其特征在于，/nS1，对干细胞培养组织采集样本，进行样本来源登记、供体筛查和外观观察、无菌检测，合格后赋予唯一识别码，然后进入分离制备阶段；/nS2，使用经S1步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞分离阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测；/nS3，使用经S2步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞扩增阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测；/nS4，使用经S3步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞收获阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测、细胞纯度检测；/nS5，使用经S4步骤检测合格的干细胞培养组织培养，产品放行阶段采集样本，进行无菌检测、细胞形态检测、产品稳定性、安全性检测；/nS6，经S5步骤检测合格的干细胞培养物放行，进入下道工序。/n

【技术特征摘要】
1.一种干细胞质量评估体系，在干细胞培养的过程中，经对不同阶段的培养组织采集样本，并进行检测，以分析干细胞质量；其特征在于，
S1，对干细胞培养组织采集样本，进行样本来源登记、供体筛查和外观观察、无菌检测，合格后赋予唯一识别码，然后进入分离制备阶段；
S2，使用经S1步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞分离阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测；
S3，使用经S2步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞扩增阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测；
S4，使用经S3步骤检测合格的干细胞培养组织培养，在干细胞收获阶段采集样本，进行无菌检测、细胞活性检测、细胞形态检测、细胞纯度检测；
S5，使用经S4步骤检测合格的干细胞培养组织培养，产品放行阶段采集样本，进行无菌检测、细胞形态检测、产品稳定性、安全性检测；
S6，经S5步骤检测合格的干细胞培养物放行，进入下道工序。


2.根据权利要求1所述的一种干细胞质量评估体系，其特征在于，
所述无菌检测包括对细菌、真菌、支原体、内毒素中的部分或全部项目的检测；
所述安全性检测包括核型分析检测、CGH检测、FISH检测、PCR检测的一种或多种；
所述细胞活性检测包括死/活细胞染色检测、克隆形成力检测中的一种或多种；
所述细胞形态检测包括形态学检测、CFU集落检测、分化潜能检测、表面标志物表达检测、增殖动力学检测中的一种或多种方式；
所述细胞纯度检测包括残留物检测；
所述稳定性包括生物学特征检测、理化特征检测。


3.根据权利要求2所述的一种干细胞质量评估体系，其特征在于，所述分化潜能检测包括成骨分化检测、成脂分化检测、成软骨分化检测。


4.根据权利要求2所述的一种干细胞质量评估体系，其特征在于，
在S2步骤中，进行死/活细胞染色检测、克隆形成力检测、表面标志物表达检测、细菌真菌检测；
在S3步骤中，进行细胞形态检测、增殖动力学检测、死/活细胞染色检测、克隆形成力检测、表面标志物表达检测、细菌真菌检测、支原体检测、内毒素检测；
在S4步骤中，进行死/活细胞染色检测、克隆形成力检测、残留物检测、表面标志物表达检测、细菌真菌检测、支原体检测、内毒素检测；
在S5步骤中，进行产品生物学特征检测、理化特征检测、核型分析、成骨分化检测、成脂分化检测、成软骨分化检测。


5.根据权利要求4所述的一种干细胞质量评估体系，其特征在于，所述表面标志物表达检测包括流式检测、ArrayData检测、PCR检测中的一种或多种方式。


6.一种干细胞质量评估体系的应用方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷彦辉，胡隽源，杨焱培，李宣宁，
申请(专利权)人：河北北科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13