一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法技术

本发明专利技术公开了一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，包括确定实验人员、确定实验仪器和试剂、细胞程序降温仪冻存、配制不同浓度比例的冻存液、检测细胞生长曲线、分析细胞面抗原表达、计算细胞成活率、复苏后形态学观察。本发明专利技术的有益效果是：本研究使用程序降温仪进行程序降温，降低在‑15℃～‑60℃这一温度区间对细胞的伤害。操作简便易行，且保持较好的细胞活力。经过对细胞复苏后的生态学比较，发现冻存液比例为DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5时，脐带间充质干细胞复苏后与新鲜细胞具有相同形态及活性，且冻存液比例为DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5时，冻存后活率最佳，复苏后形态及生长速率与正常新鲜细胞培养基本一致。

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法
本专利技术涉及一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，具体为一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，属于细胞保存

技术介绍
间充质干细胞mesenchymalstemcells,MSC是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSC）已成为细胞治疗的重要候选种子细胞,特别在各种退行性疾病和自身免疫性疾病的组织修复和免疫调节方面有良好的应用前景。但过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，所以冻存细胞是hUC-MSC研究应用的重要环节。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类来源于中胚层，具有自我复制能力的多潜能细胞，可在一定条件下分化成多种功能不同类型的组织细胞。脐带为分娩废弃物，MSC含量丰富，免疫原性低，较骨髓来源的MSC扩增能力更强，由于临床上细胞移植的供体和受体往往存在不同时性,很难保证即离即用,且充足的数量需求保证也会是一个问题。因此,为保证冻存复苏后的hUC-MSCs获得最佳生物学特性，选择最佳冻存液尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决问题而提供一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，包括以下步骤：步骤一、确定实验人员。步骤二、确定实验仪器和试剂。步骤三、细胞程序降温仪冻存，将扩增培养收集得P3代细胞进行程序降温冻存。步骤四、配制不同浓度比例的冻存液。步骤五、检测细胞生长曲线，采用MTT法检测细胞生长曲线。步骤六、分析细胞面抗原表达。步骤七、计算细胞成活率。步骤八、复苏后形态学观察，将复苏后的细胞与新鲜培养细胞的参数进行比较。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤二中，实验仪器和试剂包括：流式细胞仪、CO2培养箱、台式离心机、生物安全柜、显微镜、程序降温仪、酶标仪间充质干细胞无血清条件培养基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉诺生物），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105（BDBiosciences），anti-CD34（SantaCruzBiotechnology），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），胎牛血清、DMSO、DMEM。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤三中，将培养正常的P3代hUC-MSCs分别进行程序降温仪和程序降温盒进行降温冻存，复苏后利用程序降温仪降温的细胞的生物学特性更加稳定。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤四中，冻存液配制有5组，分别是：DMSO:FBS=1:9、DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5、DMSO:FBS:DMEM=1:8:1、DMSO:FBS:DMEM=1:7:2、DMSO:FBS:DMEM=1:6:3。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤五中，MTT法检测细胞生长曲线包括以下步骤：（1）、将细胞加入无血清培养基进行培养；（2）、取复苏后对数生长期细胞，消化成细胞悬液；（3）、以P3代未冻存细胞悬液为对照组，调整细胞密度，按每孔1*10^4接种96孔板，去除培养基，加入20微升MTT溶液，采用酶标仪分别测定5组及对照组细胞的吸光度。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤六中，采用流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105抗原。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤七中，采用台盼兰染色计算存活率，具体操作如下：冻存10个月后将细胞置于37℃恒温水浴箱中快速复苏，融化后迅速移入离心管中，加入无血清培养基进行复苏，吹吸混匀，离心弃去上清液后用台盼蓝溶液计数计算活率。本专利技术的有益效果是：该用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法设计合理，本研究使用程序降温仪进行程序降温，降低在-15℃～-60℃这一温度区间对细胞的伤害。操作简便易行，且保持较好的细胞活力。经过对细胞复苏后的生态学比较，发现冻存液比例为DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5时，脐带间充质干细胞复苏后与新鲜细胞具有相同形态及活性，且冻存液比例为DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5时，冻存后活率最佳，复苏后形态及生长速率与正常新鲜细胞培养基本一致。附图说明图1为本专利技术流程示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，包括以下步骤：步骤一、确定实验人员。步骤二、确定实验仪器和试剂。步骤三、细胞程序降温仪冻存，将扩增培养收集得P3代细胞进行程序降温冻存。步骤四、配制不同浓度比例的冻存液。步骤五、检测细胞生长曲线，采用MTT法检测细胞生长曲线。步骤六、分析细胞面抗原表达。步骤七、计算细胞成活率。步骤八、复苏后形态学观察，将复苏后的细胞与新鲜培养细胞的参数进行比较。2．进一步的，在本专利技术实施例中，所述步骤二中，实验仪器和试剂包括：流式细胞仪、CO2培养箱、台式离心机、生物安全柜、显微镜、程序降温仪、酶标仪间充质干细胞无血清条件培养基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉诺生物），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105（BDBiosciences），anti-CD34（SantaCruzBiotechnology），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），胎牛血清、DMSO、DMEM。进一步的，在本专利技术实施例中，所述步骤三中，将培养正常的P3代hUC-MSCs分别进行程序降温仪和程序降温盒进行降温冻存，复苏后利用程序降温仪降温的细胞的生物学特性更加稳定。进一步的，在本专利技术实施例中，所述步骤四中，冻存液配制有5组，分别是：DMSO:FBS=1:9、DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5、DMSO:FBS:DMEM=1:8:1、DMSO:FBS:DMEM=1:7:2、DMSO:FBS:DMEM=1:6:3。进一步的，在本专利技术实施例中，所述步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一、确定实验人员；/n步骤二、确定实验仪器和试剂；/n步骤三、细胞程序降温仪冻存，将扩增培养收集得P3代细胞进行程序降温冻存；/n步骤四、配制不同浓度比例的冻存液；/n步骤五、检测细胞生长曲线，采用MTT法检测细胞生长曲线；/n步骤六、分析细胞面抗原表达；/n步骤七、计算细胞成活率；/n步骤八、复苏后形态学观察，将复苏后的细胞与新鲜培养细胞的参数进行比较。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、确定实验人员；
步骤二、确定实验仪器和试剂；
步骤三、细胞程序降温仪冻存，将扩增培养收集得P3代细胞进行程序降温冻存；
步骤四、配制不同浓度比例的冻存液；
步骤五、检测细胞生长曲线，采用MTT法检测细胞生长曲线；
步骤六、分析细胞面抗原表达；
步骤七、计算细胞成活率；
步骤八、复苏后形态学观察，将复苏后的细胞与新鲜培养细胞的参数进行比较。


2.根据权利要求1所述的一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，其特征在于：所述步骤二中，实验仪器和试剂包括：
流式细胞仪、CO2培养箱、台式离心机、生物安全柜、显微镜、程序降温仪、酶标仪间充质干细胞无血清条件培养基、0.25%胰酶，anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105，anti-CD34，anti-CD44，细胞周期即时检测试剂盒，胎牛血清、DMSO、DMEM。


3.根据权利要求1所述的一种用于治疗的细胞制剂保护液及其配置方法，其特征在于：所述步骤三中，将培养正常的P3代hUC-MSCs分别进行程序降温仪和程序降温盒进行降温冻存，复苏后利用程序降温仪降温的细胞的生物学特性更加稳定。


4.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：王婷，邱孟广，杨志宽，杨艺，
申请(专利权)人：河南省银丰生物工程技术有限公司，银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41