【技术实现步骤摘要】
用于制备核酸文库的组合物和方法相关申请本申请为2019年4月2日提交的、专利技术名称为“用于制备核酸文库的组合物和方法”、申请号为201980002533.4的中国专利技术专利申请的分案申请。序列表本专利技术申请包含以ASCII格式电子提交并且以其全部内容作为参考并入本文的序列表。2019年3月28日创建的所述ASCII拷贝的名称为232396-228002_SL.txt并且大小为5,661字节。专利技术背景鉴别和分析复杂核酸群体是具有多种应用的活跃的发展领域。通过大规模平行核酸测序(也称为“高通量测序”或者“下一代测序”(NGS))极大地辅助了这些分析。由于如小样本输入以及操作中各个阶段的误差等困难,仍难以检测以相对低丰度存在的核酸物质。这些困难可以在如测试可能的污染物(例如,食品或水中),检测复杂群体中特定细菌的存在(例如,环境测试中)和检测,特别是在早期检测与疾病(例如,感染或癌症)有关的核酸的存在的情况中出现。专利技术概述考虑到上述内容,仍需要制备核酸文库的改善的方法。本文所公开的组合物和方法解决了这种需要,并且还提供了其它优势。在一个方面,本专利技术公开提供了制备多核苷酸文库的方法。在一些实施方式中,所述方法包括(a)在第一加尾反应中,通过不依赖模板的聚合反应将第一尾添加至多个目标多核苷酸中的每一个,其中第一加尾反应包括第一接头,所述第一接头包含杂交至第一尾的悬突;(b)在第一连接反应中,将第一接头链连接至第一尾;(c)通过使杂交至第一接头链的第一引物延伸,使包含第一接 ...
【技术保护点】
1.用于制备多核苷酸文库的方法,其特征在于,所述方法包括:/na.在第一加尾反应中,通过不依赖模板的聚合反应将第一尾添加至多个目标多核苷酸中的每一个,其中所述第一加尾反应包括第一接头,所述第一接头包含杂交至所述第一尾的悬突;/nb.在第一连接反应中,将第一接头链连接至所述第一尾;/nc.通过使杂交至所述第一接头链的第一引物延伸,使包含所述第一接头链的目标多核苷酸扩增;/nd.在第二加尾反应中,通过不依赖模板的聚合反应将第二尾添加至多个所述扩增的目标多核苷酸中的每一个,其中所述第二加尾反应包括第二接头,所述第二接头包含杂交至所述第二尾的悬突;和/ne.在第二连接反应中,将第二接头链连接至所述第二尾;/n其中可选地,所述方法进一步包含以下的一个或多个:/n1)将多核苷酸片段化以产生所述目标多核苷酸;/n2)使所述目标多核苷酸的一端或两端脱磷酸;和/或/n3)使双-链多核苷酸变性为单链多核苷酸以产生所述目标多核苷酸。/n
【技术特征摘要】
20180403 CN PCT/CN2018/0817481.用于制备多核苷酸文库的方法,其特征在于,所述方法包括:
a.在第一加尾反应中,通过不依赖模板的聚合反应将第一尾添加至多个目标多核苷酸中的每一个,其中所述第一加尾反应包括第一接头,所述第一接头包含杂交至所述第一尾的悬突;
b.在第一连接反应中,将第一接头链连接至所述第一尾;
c.通过使杂交至所述第一接头链的第一引物延伸,使包含所述第一接头链的目标多核苷酸扩增;
d.在第二加尾反应中,通过不依赖模板的聚合反应将第二尾添加至多个所述扩增的目标多核苷酸中的每一个,其中所述第二加尾反应包括第二接头,所述第二接头包含杂交至所述第二尾的悬突;和
e.在第二连接反应中,将第二接头链连接至所述第二尾;
其中可选地,所述方法进一步包含以下的一个或多个:
1)将多核苷酸片段化以产生所述目标多核苷酸;
2)使所述目标多核苷酸的一端或两端脱磷酸;和/或
3)使双-链多核苷酸变性为单链多核苷酸以产生所述目标多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法可选地包含以下的一个或多个:
i)所述多个目标多核苷酸包括单链DNA;
ii)所述目标多核苷酸包括无细胞多核苷酸,或其扩增产物;
iii)所述目标多核苷酸包括单链无细胞DNA(cfDNA);
iv)所述第一加尾反应中目标多核苷酸的量为约0.1-500ng、1-100ng或者5-50ng;
v)所述目标多核苷酸的平均长度为约50至600个核苷酸;
vi)在权利要求1的所述脱磷酸步骤之前处理所述目标多核苷酸以差异修饰甲基化的胞嘧啶或未甲基化的胞嘧啶,其中可选地所述差异修饰包括用亚硫酸氢盐处理所述目标多核苷酸或基于酶的转化;
vii)通过聚合酶催化所述不依赖模板的聚合反应,其中可选地述聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT);
viii)所述第一尾包含不同于所述第二尾的序列;
ix)所述第一尾和所述第二尾包含相同的序列;
x)所述第一尾,所述第二尾或两者由一种或两种类型的核苷酸组成;
xi)所述第一尾,所述第二尾或两者选自多聚-A、多聚-C和多聚-C/T;
xii)所述尾中的至少一个由从两种类型的核苷酸的池聚合的两种类型的核苷酸组成,其中所述池中的所述两种类型的核苷酸以相同或不同的量存在,其中可选地所述池中的所述两种类型的核苷酸处于约9:1,5:1,3:1或1:1的比例;
xiii)所述第一接头和所述第二接头包括多核苷酸序列不同的双-链区;
xiv)所述第一和/或第二接头的悬突为3'-悬突;
xv)所述第一和/或第二接头的悬突的长度为6至12个核苷酸;
xvi)(A)所述第一加尾反应和所述第一连接反应在相同反应混合物中发生,和/或(B)所述第二加尾反应和所述第二连接反应在相同反应混合物中发生;和/或
xvii)所述扩增包括线性扩增。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括通过使杂交至所述第二接头链的第二引物延伸来扩增包含所述第二接头链的目标多核苷酸;
其中可选地,与所述第一接头链杂交的所述第一引物的序列不同于与所述第二接头杂交的所述第二引物的序列;
其中可选地,其中使用杂交至所述第二接头链的引物的扩增是指数扩增;和/或
其中可选地,所述方法还包括对包含所述第二引物的扩增的扩增产物测序。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,还包括使用第三引物和第四引物的扩增反应,其中
i)所述第三引物杂交至所述第一引物的至少一部分的互补序列;和
ii)所述第四引物杂交至所述第二引物的至少一部分的互补序列;
其中可选地,所述第三引物的可杂交序列不同于所述第一引物的可杂交序列,和/或所述第四引物的可杂交序列不同于所述第二引物的可杂交序列;
其中可选地,所述第三引物和所述第四引物的序列是不同的;
其中可选地,所述第三引物,所述第四引物或两者包含鉴别所述目标多核苷酸的样品来源的索引序列;
其中可选地,所述方法还包括对包含所述第三和第四引物的扩增的扩增产物测序;
其中可选地,所述方法还包括根据所述索引序列将测序读序分组;和/或
其中可选地,所述测序包括相对于参考序列,检测序列变体或核苷酸甲基化中的差异。
5.用于权利要求1所述的方法中使用的组合物。
6.权利要求1所述方法所产生的多核苷酸。
7.用于制备多核苷酸文库的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
a.不依赖于模板的聚合酶;
b.可以通过所述不依赖于模板的聚合酶聚合的第一核苷酸池;
c.可以通过所述不依赖于模板的聚合酶聚合的第二核苷酸池;
d.第一接头,其包含可杂交至通过所述第一多核苷酸池的聚合所形成的尾的悬突;和
e.第二接头,其包含可杂交至通过所述第二多核苷酸池的聚合所形成的尾的悬突,其中所述第二接头包含与所述第一接头不同的序列。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,可选地包含以下的一个或多个:
i)所述不依赖于模板的聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT);
ii)所述第一池和所述第二池中的至少一个含有在另一个池中不存在的至少一种类型的核苷酸;
iii)所述第一池和所述第二池包含相同的一种或多种类型的核苷酸;
iv)所述第一池,所述第二池或两者由一种或两种类型的核苷酸组成;
v)所述第一池,所述第二池或两者选自(A)dATP的池、(B)dCTP的池、和(C)dCTP和dTTP的池;
vi)所述第一池和所述第二池中的至少一个由以相同或不同的量存在的两种类型的核苷酸组成,其中可选地,所述池中的所述两种类型的核苷酸处于约9:1,5:1,3:1或1:1的比例;
vii)所述第一接头和所述第二接头包括多核苷酸序列不同的双-链区;
viii)所述第一和/或第二接头的悬突为3'-悬突;和/或
ix)所述第一和/或第二接头的悬突的长度为6至12个核苷酸。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,还包括
i)在引物延伸反应条件下可杂交至第一接头链的第一引物;和/或
ii)在引物延伸反应条件下可杂交至第二接头链的第二引物,其中可选地,可杂交至所述第一接头链的所述第一引物的序列不同于可杂交至所述第二接头的所述第二引物的序列。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,还包括第三引物和第四引物,其中
i)在引物延伸反应条件下,所述第三引物可杂交至所述第一引物的至少一部分的互补序列;和
ii)在引物延伸反应条件下,所述第四引物可杂交至所述第二引物的至少一部分的互补序列;
其中可选地所述第三引物的可杂交序列不同于所述第一引物的可杂交序列,和/或所述第四引物的可杂交序列不同于所述第二引物的可杂交序列;
其中可选地,所述第三引物的可杂交序列相对于所述第一引物的可杂交序列5'杂交,和/或所述第四引物的可杂交序列相对于所述第二引物的可杂交序列5'杂交;
其中可选地,所述第三引物和所述第四引物的序列是不同的;
其中可选地,所述第三引物,所述第四引物或两者包含鉴别所述目标多核苷酸的样品来源的索引序列。
11.用于制备多核苷酸文库的方法,其特征在于,所述方法包括:
a.在第一加尾反应中,通过不依赖模板的聚合反应将第一尾添加至多个目标多核苷酸中的每一个,其中所述第一加尾反应包括...
【专利技术属性】
技术研发人员:张之宏,郑涛,李冰思,邓望龙,汉雨生,
申请(专利权)人:广州燃石医学检验所有限公司,
类型:发明
国别省市:广东;44
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