一种用于均衡文库浓度的文库构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，包括：核酸片段化及加接头、文库扩增环节，其特征在于主要通过文库扩增环节达到均衡各样本文库的浓度。本发明专利技术还公开了所述用于均衡文库浓度的文库构建方法的应用，包括扩增文库纯化及回收和上机测序。本发明专利技术公开的用于均衡文库浓度的文库构建方法简单快捷，输出文库质量高，浓度水平一致，简化了后续文库定量流程和混样流程，适用于各平台测序领域。

【技术实现步骤摘要】
一种用于均衡文库浓度的文库构建方法及其应用
本专利技术属于高通量测序
，尤其涉及一种用于均衡多个文库浓度的文库扩增方法及其应用。
技术介绍
自从DNA双螺旋结构被发现，核酸检测技术在研究健康和疾病相关的基因组的复杂性和多样性方面取得了长足进展。随着测序技术的不断发展，其性能不断完善，尤其是高通量测序技术出现以来，其在准确性、通量上不断完善，且成本也在不断下降，使得其在多方面得到了成功应用，包括肿瘤筛查、基因检测、病原体筛查等领域都得到了广泛应用。虽然高通量测序技术取得了巨大的进步，但这些进步仍存在着新的不足和挑战。新技术的出现并不意味着已存在的问题将得到很好的解决，甚至会更加突出而且有可能出现新的问题。高通量测序平台能够提供海量的测序数据，但得到这些数据的质量是由前期的样本制备及文库构建质量决定的。不同的样本类型以及不同的样本制备方法得到的核酸样本差异巨大。由于在常规测序流程中，通常受到最小上样量的限制，使得某些样本类型或样本制备方法制备的核酸浓度难以满足上样量需求，而导致测序结果质量不佳，甚至数据不可用，尤其是多个样本在一个Ru本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，包括：核酸片段化及加接头、文库扩增环节，其特征在于主要通过文库扩增环节达到均衡各样本文库的浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，包括：核酸片段化及加接头、文库扩增环节，其特征在于主要通过文库扩增环节达到均衡各样本文库的浓度。


2.根据权利要求1所述的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，所述核酸片段化及加接头的具体操作步骤为：根据不同测序平台的要求进行核酸片段化和加接头，其中片段化可采用常规的片段化方法，包括机械打断法和酶法打断法；初始核酸浓度可为0.1pg/μL～100ng/μL；加完接头的核酸需用1.8×磁珠进行纯化。


3.根据权利要求1所述的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，所述文库扩增的具体操作步骤为：扩增体系为50μL反应体系，按要求依次加入无核酸酶水、20μL加接头的产物、10μL5×FidelityBuffer、1.5μLdNTPs(10mM)、1.5μL上游引物(10μM)、5μL下游引物磁珠、1μLKAPAHiFiHotstarDNA聚合酶，混合均匀，置于PCR仪中进行反应。


4.根据权利要求3所述的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，所述反应的反应程序为：95℃3min；98℃20s→60℃15s→72℃20s，循环25-30次，72℃1min；所述下游引物磁珠为链霉亲和素磁珠，其浓度为10mg/mL；磁珠表面结合有下游引物，所述下游引物通过生物素与磁珠表面的链霉亲和素结合；结合在磁珠上的引物浓度为0.2pmol/μL。


5.根据权利要求4所述的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，所述下游引物磁珠的制备过程，包括如下步骤：
步骤S1：取100μL混合均匀的链霉亲和素磁珠，加入1mL的1×B&W缓冲液，混合均匀；
步骤S2：将反应管置于磁力架上2min，弃上清；
步骤S3：将反应管从磁力架上取下，加入100μL的1×B&W缓冲液，重悬磁珠；
步骤S4：重复步骤2-3两次，共重复3次；
步骤S5：将放应管置于磁力架上2min，弃上清；
步骤S6：加入200μL2×B&W缓冲液，加入等体积的10μM的下游引物，室温孵育10min；
步骤S7：将反应管置于磁力架上，静置5min至溶液变澄清，弃上清；
步骤S8：用1×B&W缓冲液洗2次；
步骤S9：用1000μL无核酸酶水重悬磁珠，即得下游引物磁珠。


6.根据权利要求5所述的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：盖伟，边素莹，
申请(专利权)人：微岩医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11