抗CK14蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种可以识别人CK14抗原的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。上述技术方案化学合成CK14蛋白C末端的410

【技术实现步骤摘要】
抗CK14蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗CK14蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞的结构蛋白分为角蛋白、波形蛋白、肌间线蛋白、神经胶质酸性蛋白，其中波形蛋白、肌间线蛋白、神经胶质酸性蛋白表达在间叶细胞、肌肉细胞、和胶质细胞中，细胞角蛋白(Cytoceratin，CK)主要特异表达在人类上皮组织中，其约由种亚型组成，具有维持上皮细胞或组织结构稳定性作用外，还参与上皮细胞的信号转导、细胞增殖调控、调亡、恶性转化和各种应激反应不同肿瘤组织中存在特异性的细胞角蛋白类型的表达，细胞角蛋白的表达不仅与肿瘤的病因学有关系，而且还参与了肿瘤组织的发生、发展过程，可应用与不同肿瘤组织的诊断、分型及预后判断。
[0003]细胞角蛋白14(Cytoceratin，CK14)是一种分化特异的蛋白质，属于酸性细胞角蛋白家族。CK14的表达仅限于各种来源的肌上皮和角化复层上皮的基底细胞，是组成细胞骨架的蛋白质之一。已有研究表明，CK14在肺鱗癌、乳腺浸润性导管癌等恶性肿瘤中高表达，此外有研究表明CK14的高表达与食管鱗状细胞癌和宫颈癌变过程、发展及预后有关。

技术实现思路

[0004]专利技术人提供了一种抗CK14蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
[0005]进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0006]进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CK14蛋白。
[0007]进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。
[0008]进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO 20761的杂交瘤细胞株产生。
[0009]专利技术人又提供了一种抗CK14蛋白单克隆抗体的制备方法，选取CK14蛋白中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列(第458位至第472位),在其羧基端添加了一个半胱氨酸后，与载体蛋白KLH进行偶联作为免疫原。
[0010]专利技术人还提供了一株分泌抗CK14蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株2G4，所述细胞株已于2020年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 20761，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0011]专利技术人还提供了上述单克隆抗体在CK14蛋白免疫检测中的用途。
[0012]进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
[0013]专利技术人最后提供了一种CK14蛋白免疫组化检测试剂，所述免疫组化检测试剂含有
重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的抗CK14蛋白单克隆抗体为其有效成分。
[0014]区别于现有技术，本专利技术所产生的有益技术效果为：上述技术方案选取CK14蛋白C末端的第458位至第472位氨基酸为抗原肽,偶联KLH后得到的免疫原对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CK14蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株2G4,以及由该细胞株所分泌的抗CK14蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CK14蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。
附图说明
[0015]图1为食道鳞癌免疫组化染色结果对比图；其中左为2G4分泌的CK14，右为市售CK14。
[0016]图2为扁桃体免疫组化染色结果对比图；其中左为2G4分泌的CK14，右为市售CK14。
具体实施方式
[0017]为详细说明技术方案的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
[0018]实施例1免疫原的制备
[0019]一、免疫原制备
[0020]依据Uniprot中登录号为P02533蛋白质序列进行序列和二级结构分析，全长为472个氨基酸长度的CK14蛋白分子量约为51kDa左右。依据通过在线服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/预测的蛋白的二级结构(secondary structure)和表面可及性(Surface Accessibility)参数，并通过对其抗原性指数(Jameson BA,Wolf H.The antigenic index:a novel algorithm for predicting antigenic determinants.Comput Appl Biosci.1988,4(1):181
‑
6.)的分析结果，选择第458
‑
472位的氨基酸序列SEQ ID NO.1作为抗原肽进行化学合成，为便于偶联，在该多肽的羧基端添加了一个半胱氨酸用于提供巯基偶联。
[0021]二、多肽的偶联及纯化
[0022]选择Thermo Scientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂(Thermo Scientific，货号：22582)检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100μL Ellman试剂储备液，再加入10μL多肽溶，液用Nano Drop分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200μL去离子水，配制成10mg/mL的KLH溶液，在500μL的Imject EDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500μL多肽溶液加入到200μL的载体蛋白溶液中，将1mL去离子水加入到一个包装的EDC(10mg)中，缓慢振摇至完全溶解，取50μL加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未偶联的交联剂和盐类，得到CK14
‑
KLH。
[0023]实施例2杂交瘤细胞系的建立
[0024]一、免疫
[0025]将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CK14蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CK14蛋白。4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO 20761的杂交瘤细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：周洪辉，高惠然，杨清海，陈惠玲，王小亚，
申请(专利权)人：福州迈新生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：