靶向巨噬细胞的RIPK1及其抑制剂在筛选和制备肝损伤诊疗药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向巨噬细胞的RIPK1及其抑制剂在筛选和制备肝损伤诊疗药物中的应用。本发明专利技术通过将RIPK1激酶失活小鼠骨髓移植到正常的C57小鼠体内，构建非酒精性脂肪肝、肝硬化和肝纤维化模型，结果表明移植RIPK1激酶失活骨髓的小鼠的肝功能显著优于移植C57小鼠骨髓的小鼠，其血清中谷丙转氨酶和甘油三酯含量明显下降，且从脂质成分病理染色结果等均说明移植RIPK1激酶失活骨髓的小鼠能够明显缓解脂肪肝病变，显著降低脂质蓄积，并且发现RIPK1激酶失活可以显著降低棕榈酸诱导的骨髓巨噬细胞的炎症和死亡。靶向巨噬细胞的RIPK1激酶活性位点可作为筛选治疗脂肪肝、肝硬化和肝纤维化等肝损伤疾病的药物靶标，其抑制剂可用于制备治疗肝损伤疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】
靶向巨噬细胞的RIPK1及其抑制剂在筛选和制备肝损伤诊疗药物中的应用
本专利技术属于基因的功能与应用
，涉及一种受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶1(receptorinteractingserine/threoninekinase1，RIPK1)及其抑制剂在筛选和制备肝损伤诊疗药物中的应用。
技术介绍
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪储积为特征的临床病理综合症，病谱随病程的进展而表现不一，包括单纯性脂肪肝、非酒精性肝炎(Nonalcoholicsteatohepatitis,NASH)、肝硬化甚至肝细胞癌。NAFLD与肥胖症、代谢综合征和2型糖尿病密切相关，被认为是终末期肝衰竭的主要原因。许多患有NAFLD的患者发展为更具炎症性的亚型-非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和晚期肝纤维化或肝硬化。NASH的病理生理学是多因素的，尚未完全了解。然而，肝驻留巨噬细胞(库弗细胞)和巨噬细胞的募集在肝疾病进展中起着主要作用。在肝病的不同阶段，常驻库弗细胞(Kupffercells)和新近募集的单核细胞衍生的巨噬细胞在炎症、纤维生成和纤维溶解的调节中起着关键作用。肝损伤后，库弗细胞会募集更多的免疫细胞，包括中性粒细胞和炎性血液单核细胞，这些细胞会分化为具有吞噬活性并分泌促炎细胞因子和活性氧(ROS)的CD11b+F4/80+经典活化的巨噬细胞(M1型)(TackeandZimmermann,2014)。在疾病模型中，已经在小鼠饮食模型中证明了肝巨噬细胞浸润，例如高脂肪饮食(HFD)和蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCD)，并且还与小鼠年龄增长相关。在高脂肪和高胆固醇(HFHC)饮食NASH模型中，该模型复制了人类NASH的许多病理生理特征，观察到F4/80+巨噬细胞的浸润以及激活了Kupffer细胞，并增加促炎性细胞因子的表达(Tacke,2017)。除了NAFLD和NASH之外，巨噬细胞在肝免疫稳态和其他肝病的发展中也起着重要作用，例如慢性病毒性肝炎和酒精性肝病。受体相互作用蛋白1(receptor-interactingprotein1，RIP1，亦称为RIPK1)是细胞死亡的关键调控分子，在调控细胞存活、细胞死亡以及炎症反应的发生等过程中发挥了重要作用，是一个决定细胞命运的重要传感器分子。1995年stanger等通过酵母双杂交实验发现了RIP家族中第一个成员RIPK1，其C末端为死亡结构域，能够与死亡受体家族成员Fas相互作用，因而命名为受体相互作用蛋白。RIPK1对机体的正常发育起着不可或缺的作用。研究发现敲除RIPK1基因的小鼠会因淋巴细胞和脂肪组织过量凋亡而在出生后的1～3d死亡(Xuetal.,2018,Liuetal.,2017,Kaiseretal.,2014)。一方面，RIPK1是TNF信号通路的重要组成部分，在TNFα激活的信号通路中，RIPK1通过发生泛素化，作为支架蛋白招募并结合下游信号分子从而介导NF-κB的活化以及细胞存活(Kondylisetal.,2017,Dondelingeretal.,2015)。另一方面，当RIPK1去泛素化后，通过与caspase-8和FADD蛋白结合，介导细胞凋亡的发生；但当caspase-8被化学抑制剂抑制或者遗传性缺失时，RIPK1则通过与RIP3之间的相互作用，促进细胞执行程序性坏死(necrosis)(Newtonetal.,2019,Dillonetal.,2014,Wangetal.,2008)。因此，RIPK1处于决定细胞命运的关键交叉点。RIPK1的表达水平、蛋白质修饰状态以及与其他蛋白分子的相互作用等因素决定了细胞命运的选择，是继续存活还是走向死亡(Newton,2015,Christoffersonetal.,2014,OfengeimandYuan,2013)。RIPK1激酶作为决定细胞命运走向的关键分子，参与调控了包括NF-κB信号通路、细胞凋亡和坏死、炎症小体活化和细胞焦亡等多条重要的信号通路和细胞效应，因此其很可能参与多种疾病尤其是与细胞死亡和炎症反应密切相关的疾病的发生和发展。目前针对RIPK1激酶已经开发出一些小分子抑制剂，包括Nec-1、Nec-1s、GSK547和GSK963等。已有研究证实使用Nec-1抑制RIPK1激酶活性能够降低细胞的死亡和炎症，在一些炎症和坏死性疾病中发挥重要作用(TakahashiNetal.2012)，但在非酒精性脂肪肝、肝纤维化和肝硬化疾病中尚未见相关研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供靶向巨噬细胞的RIPK1及其抑制剂在筛选和制备肝损伤诊疗药物中的应用。一方面，本专利技术提供靶向巨噬细胞的RIPK1作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗肝损伤疾病的药物中的应用。另一方面，本专利技术提供靶向巨噬细胞的RIPK1抑制剂在制备肝损伤治疗药物中的应用。具体地，本专利技术中，所述的肝损伤疾病为本领域技术人员知晓的疾病，包括但不限于脂肪肝、肝硬化和肝纤维化等。具体地，本专利技术中，所述的靶向巨噬细胞的RIPK1抑制剂，包括但不限于能够使RIPK1激酶失活的小分子化合物抑制剂，或能够抑制RIPK1基因表达和/或RIPK1激酶失活的siRNA。更具体地，所述的siRNA为以RIPK1为靶基因、干扰RIPK1表达和激酶失活的双链siRNA，注射入人体通过RNA干扰的方法使RIPK1激酶失活来治疗脂肪肝、肝硬化和肝纤维化等肝损伤疾病。更具体地，所述的小分子化合物抑制剂为以RIPK1为靶点，能够特异性抑制RIPK1激酶活化，实现治疗脂肪肝、肝硬化和肝纤维化等肝损伤疾病的治疗。包括但不限于Nec-1、Nec-1s、GSK547和GSK963等。专利技术人发现移植RIPK1激酶失活骨髓的小鼠的肝功能显著优于移植C57小鼠骨髓的小鼠，其血清中谷丙转氨酶(ALT)的含量明显下降，且从脂质成分病理染色结果等均说明移植RIPK1激酶失活骨髓的小鼠能够明显缓解脂肪肝病变，显著降低脂质蓄积。体外实验通过分离培养RIPK1激酶失活小鼠和C57小鼠的原代骨髓巨噬细胞，发现RIPK1激酶失活可以显著降低棕榈酸诱导的骨髓巨噬细胞的炎症和死亡。附图说明图1为小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)的含量图，A为血清中谷丙转氨酶(ALT)的含量；B为血清中甘油三酯(TG)的含量。图2为小鼠的肝组织苏木精和伊红(HE)染色图，A为移植C57小鼠和RIPK1激酶敲除小鼠在MCD饮食诱导模型的肝组织染色；B为骨髓移植小鼠在MCD饮食诱导模型的肝组织染色。图3为小鼠的肝组织天狼星染色图，A为移植C57小鼠和RIPK1激酶敲除小鼠在MCD饮食诱导模型的肝组织染色；B为骨髓移植小鼠在MCD饮食诱导模型的肝组织染色。图4为棕榈酸(PA)诱导小鼠原代骨髓巨噬细胞的炎症和死亡结果图，A为棕榈酸诱导的骨髓巨噬细胞炎症因子IL-1β的表达；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向巨噬细胞的RIPK1作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗肝损伤疾病的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.靶向巨噬细胞的RIPK1作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗肝损伤疾病的药物中的应用。


2.靶向巨噬细胞的RIPK1抑制剂在制备肝损伤治疗药物中的应用。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的肝损伤疾病为脂肪肝、肝硬化或肝纤维化。


4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的靶向巨噬细胞的RIPK1抑制剂为使RIPK1激酶失活的小分子化合物抑制剂，或抑制RIPK1基因表达和/或RIPK...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁丹，义玉国，陶亮，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32