去除衰老细胞的方法和衰老细胞的制备方法技术

本发明专利技术的解决课题在于选择性地杀死或去除衰老细胞的方法和物质的鉴定以及纯化衰老细胞的方法。具体而言，本发明专利技术提供一种衰老细胞去除剂和包含该去除剂的医药组合物，所述衰老细胞去除剂是用于去除生物体内的衰老细胞的药剂，其含有谷氨酰胺酶抑制剂作为有效成分。进而，本发明专利技术提供一种制备衰老细胞的方法，包括以下的工序(a)～(c)。(a)使细胞同步到G2期的工序，(b)将同步到G2期的细胞内的p53蛋白进行活化的工序，以及(c)抑制进行了工序(b)的处理的细胞内的PLK1(保罗样激酶1，polo‑like kinase 1)活性的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】去除衰老细胞的方法和衰老细胞的制备方法
本专利技术涉及从个体去除衰老细胞的方法。进而，本专利技术涉及纯化的衰老细胞的制备方法。
技术介绍
对迎来超高龄的现代社会而言，延长健康寿命是现代科学应解决的最重要课题之一。为了延长健康寿命，显然医疗系统的改革、生活习惯病、饮食习惯等的改善是有效的手段。但是，为了根本性应对健康寿命，从俯瞰的角度理解衰老控制机制，以及预防随着衰老的年龄增长性疾病、脏器·组织的功能降低的技术的开发是必要不可或缺的。迄今为止，认为细胞衰老是细胞增殖的不可逆的停止，并被定位为癌症防御机制之一，但另一方面，开始认为细胞衰老在个体层面的衰老、与衰老相关联的疾病中发挥着某种作用。显示衰老细胞分泌炎性细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶和生长因子等，该现象被称为衰老相关分泌表型(senescence-associatedsecretoryphenotype：SASP)，表明与衰老相关疾病的发病相关联(非专利文献1～非专利文献3)。近年来，对衰老控制机制的阐明产生了重大的结构思想的改变。Baker等报告了根据使用早老性模型小鼠的遗传学解析，如果从老龄个体中人工去除衰老细胞，则动脉硬化、肾功能障碍等老年病的发病明显延迟，甚至寿命本身也延长(非专利文献4)。进而，在非早老性小鼠中，调查了衰老细胞对健康寿命造成的影响，结果表明，如果作为衰老细胞的生物标志物之一的p16阳性细胞在体内蓄积，则寿命趋于变短，如果去除p16阳性细胞，则个体的健康寿命有可能延长等(非专利文献5)。因此，能够将存在于生物体内的衰老细胞选择性地杀死或去除的药剂的开发关系到健康寿命的延长、针对随着年龄增长的疾病(动脉硬化症、骨质疏松症)的治疗的新的方法论的建立。但是，细胞的衰老由于由各种基因组压力诱导，因此，依赖于诱导刺激的种类而特异性的信号通路被活化。因此，为了明确所有与衰老细胞共通的转录物组、代谢物组状态，没有外部刺激且100％纯化的衰老细胞制备技术的开发是必要不可或缺的。迄今为止，专利技术人等明确了在G2期中p53被活化对细胞衰老的诱导而言是充分必要的(非专利文献6)。然而，目前还没有建立稳定地制备纯化的衰老细胞的技术。现有技术文献非专利文献非专利文献1:Campisi等,Annu.Rev.Physiol.75:685-7052013非专利文献2:Shapless等,natureRev.Cancer15:397-4082015非专利文献3:vanDeursen,Nature509:439-4462014非专利文献4:Baker等,Nature479:232-2362011非专利文献5:Baker等,Nature530:184-1892016非专利文献6:Johmura等,MolCell55:73-842014
技术实现思路
鉴于上述情况，本专利技术人等以建立纯化衰老细胞的方法为目标，并且以选择性地杀死或去除衰老细胞的方法和物质的鉴定为解决课题。专利技术人等首先尝试了衰老细胞的纯化。迄今为止，已表明在将细胞同步到G2期的状态下将肿瘤抑制蛋白的p53进行活化对细胞衰老的诱导而言是充分必要的(非专利文献6)。专利技术者人等在基于该见解诱导了细胞衰老的基础上，对制备纯化的衰老细胞群体(仅衰老细胞的细胞群体)的方法进行了研究，结果发现，如果将G2期细胞的p53活化，并进一步抑制PLK1(保罗样激酶1，polo-likekinase1)的活性，则能够进行衰老细胞的纯化。进而，专利技术人等使用上述的纯化衰老细胞的培养系统并通过气相色谱法进行了衰老细胞的代谢物组解析。其结果表明，在衰老细胞中，由于活性氧量的上升而从柠檬酸向异柠檬酸的转化反应被抑制，α酮戊二酸的产生和其以后的柠檬酸循环的旋转有可能依赖于谷氨酰胺代谢途径(Glutaminolysis)。因此，利用药剂抑制衰老细胞的谷氨酰胺代谢，结果明确对衰老细胞诱导了选择性的细胞死亡。本专利技术是基于以上的见解而完成的。即，本专利技术为以下的(1)～(8)。(1)一种衰老细胞去除剂，是用于去除生物体内的衰老细胞的药剂，含有谷氨酰胺酶抑制剂作为有效成分。(2)根据上述(1)所述的衰老细胞去除剂，其特征在于，所述谷氨酰胺酶为KGA(肾型谷氨酰胺酶，Kidney-typeglutaminase)。(3)一种用于随着年龄增长而发病的疾病的预防或治疗的医药组合物，包含上述(1)或(2)所述的衰老细胞去除剂。(4)根据上述(3)所述的医药组合物，其中，所述疾病为动脉硬化症、骨质疏松症、白内障、青光眼、痴呆症、帕金森氏病、肺纤维症、慢性阻塞性肺疾病、癌、2型糖尿病、慢性肾衰竭、心脏肥大、肝硬化、肌肉衰减症或消瘦。(5)一种方法，是制备衰老细胞的方法，包括以下的工序(a)～(c)。(a)使细胞同步到G2期的工序，(b)将同步到G2期的细胞内的p53蛋白进行活化的工序，以及(c)抑制进行了工序(b)的处理的细胞内的PLK1(保罗样激酶1，polo-likekinase1)活性的工序。(6)根据上述(5)所述的方法，其中，所述(a)为使CDK1(周期蛋白依赖性激酶1，Cyclin-dependentkinase1)活性抑制剂与所述细胞接触的工序。(7)根据上述(5)所述的方法，其中，所述(b)为使Mdm2蛋白抑制剂与所述细胞接触的工序。(8)根据上述(5)所述的方法，其中，所述(c)为使PLK1活性抑制剂与所述细胞接触的工序。根据本专利技术，能够有效地制备纯化的衰老细胞群体。根据本专利技术，能够去除存在于生物体内的衰老细胞。其结果，可期待个体的健康寿命的延长，并且能够开发随着年龄增长的疾病的预防和治疗法、治疗剂。附图说明图1是衰老细胞的制备。A表示100％纯化衰老细胞的制备时间表的一个例子。另外，表示从制备开始起第21天的细胞中的SA-β-gal阳性细胞的比例(B)和p16mRNA的表达量。图2是衰老细胞中的谷氨酰胺酶的表达量的研究。A表示使用来自衰老诱导后的细胞(衰老细胞)和衰老诱导前的细胞(正常细胞)的细胞提取液并利用针对KGA和GAC的抗体进行蛋白质印迹而得的结果。B表示通过qPCR测定衰老细胞和正常细胞中的KGA和GAC的mRNA表达量而得的结果。C表示通过荧光素酶报告基因检测来调查衰老细胞和正常细胞中的各谷氨酰胺酶mRNA的稳定性而得的结果。图3是衰老细胞中的谷氨酰胺代谢的作用的研究。A是示意性地表示谷氨酰胺代谢的图(上图)以及调查谷氨酰胺酶抑制剂(BPTES)对衰老细胞和正常细胞的影响的结果(下图)。B表示使用来自衰老细胞和正常细胞的细胞提取液并利用抗体检测BPTES或BPTES+DM-KG(跨膜型α-酮戊二酸)的存在下或非存在下的S6K蛋白T389的磷酸化、S6K蛋白、p16蛋白量而得的结果。C是测定衰老细胞和正常细胞中的BPTES或BPTE+DM-KG(跨膜型α-酮戊二酸)的存在下或非存在下的IL-6和IL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种衰老细胞去除剂，是用于去除生物体内的衰老细胞的药剂，含有谷氨酰胺酶抑制剂作为有效成分。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181108 JP 2018-2103001.一种衰老细胞去除剂，是用于去除生物体内的衰老细胞的药剂，含有谷氨酰胺酶抑制剂作为有效成分。


2.根据权利要求1所述的衰老细胞去除剂，其特征在于，所述谷氨酰胺酶为KGA即肾型谷氨酰胺酶。


3.一种用于随着年龄增长而发病的疾病的预防或治疗的医药组合物，包含权利要求1或2所述的衰老细胞去除剂。


4.根据权利要求3所述的医药组合物，其中，所述疾病为动脉硬化症、骨质疏松症、白内障、青光眼、痴呆症、帕金森氏病、肺纤维症、慢性阻塞性肺疾病、癌、2型糖尿病、慢性肾衰竭、心脏肥大、肝硬化、...

【专利技术属性】
技术研发人员：中西真，城村由和，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP