一种基于元素标记-电感耦合等离子体质谱检测策略的cfDNA分析方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种金属探针及其基于ICP‑MS检测cfDNA的方法。本发明专利技术利用含有稀土金属的化合物标记DNA制备金属探针，利用碱基互配和“三明治模型”对特定序列的游离核酸cfDNA进行标记，标记后的目标序列通过ICP‑MS对金属探针上的稀土金属离子的定量，实现间接对目标cfDNA的定量。本发明专利技术可以对血浆或积液中提取出来的cfDNA特定片段进行检测，且检出限在现有方法的基础上大大降低，可以准确定量cfDNA到ng/L级别，检测方法更加简单高效，检测结果更加准确。

【技术实现步骤摘要】
一种基于元素标记-电感耦合等离子体质谱检测策略的cfDNA分析方法及其应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种金属探针及其基于ICP-MS检测cfDNA的方法。
技术介绍
细胞外游离核酸(cfDNA)是自身免疫性疾病的分子标志物，其对类风湿性关节炎疾病的研究至关重要。cfDNA在生物体血浆内的含量非常低(200ug/L)，但在类风湿性关节炎病人积液当中浓度会显著增加。目前传统的生物标志物检测方法有：PCR、荧光染料法、荧光光谱法和电化学等方法。传统方法的检出限只能达到mg/L，但实际应用过程中并达不能到检出限级别的准确定量。因此样品常需要富集或者PCR处理才能检出，如中国专利申请CN201910180935.5公开一种血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，该方法在进行富集甲基化实验后需经过PCR扩增，再进行后续的检测。但是，过多的前处理可能会造成定量结果的偏差。综上，开发和研究更高要求的分析检测手段是cfDNA定量方法发展的趋势之一。因此，亟待于提供一种前处理简单、检测方法简便高效和结果准确的cfDNA的分析方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种金属探针及其基于ICP-MS检测cfDNA的方法。本专利技术所述金属探针可以对血浆或积液中提取出来的cfDNA特定片段进行检测，结合有较大线性范围的ICP-MS检测，实现浓度差距较大的样品同时检测，和对多种待测核酸同时检测，方法简单高效，检测结果准确。本专利技术的目的是提供一种金属探针的制备方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种金属探针，所述金属探针中DNA-SH端上的-SH与螯合剂连接，螯合剂螯合稀土金属离子；其中，所述金属探针中DNA序列为5'-CGGACAAACTTCTTGGCGTAAA-3'。本专利技术利用含有稀土金属的化合物标记DNA制备金属探针，利用碱基互配和“三明治模型”对特定序列的游离核酸(cfDNA)进行标记，其原理简单，操作便捷。标记后的目标序列通过ICP-MS对金属的定量，实现间接对cfDNA的定量。本专利技术还可以对多种待测核酸片段进行检测，只要有相应的特征片段，就可以任意组合。本专利技术所述金属探针的制备方法，包括以下步骤：S1-1.将巯基修饰的DNA与三(2-氯乙基)磷酸酯反应，还原二硫键，得到DNA-SH；S1-2.加入螯合剂DOTA反应，得到螯合后的DNA-DOTA溶液；S1-3.加入稀土金属离子溶液，与螯合后的DNA-DOTA溶液发生螯合反应，得到金属探针；所述螯合剂DOTA的结构如式(I)所示：其中，式(I)所示螯合剂DOTA是一个双官能团的螯合物，稀土金属在多元环内可形成稳定络合物，另一端的马来酰亚胺可与巯基修饰后的DNA发生反应。优选地，步骤S1-3.中，所述稀土金属为铽、镧、铈或钆。更优选地，步骤S1-3.中，所述稀土金属为铽。优选地，步骤S1-2.中，所述螯合剂DOTA与DNA-SH的摩尔比为10～20：1。更优选地，步骤S1-2.中，所述螯合剂DOTA与DNA-SH的摩尔比为20：1。优选地，步骤S1-3.中，所述稀土金属与巯基修饰的DNA的摩尔比为30～40：1。更优选地，步骤S1-3.中，所述稀土金属与巯基修饰的DNA的摩尔比为40：1。优选地，对制备得到的金属探针经进一步纯化，所述纯化方法是利用高效液相色谱过柱进行洗脱，洗脱后得到的产物冻干。本专利技术同时还保护所述金属探针或所述制备方法在检测cfDNA含量中的应用。一种cfDNA含量的检测方法，包括以下步骤：S2-1.加入待测cfDNA、金属探针和捕获探针，进行杂交反应，得到“三明治模型”；S2-2.将“三明治模型”加入到有链亲霉素包被的96孔板中，固定cfDNA，洗涤；S2-3.加入硝酸，80～90℃下加热反应后，定容，ICP-MS检测，根据标准曲线测定cfDNA含量；其中，所述捕获探针中DNA序列为5'-TTATGTGTCTGCCACTGGTGC-3'。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)作为一种痕量多元素分析手段，通过元素标记策略对生物大分子进行检测可以充分利用ICP-MS的优势，将生物体中不存在以及对ICP-MS检测没有干扰、灵敏度高的元素标记在生物大分子上，并通过ICP-MS对标记的元素进行检测，从而实现对生物大分子的定性和定量分析。该方法具有以下优点:(1)元素标记不需要探针具有光学、电化学等特性，标记的元素可通过ICP-MS直接检测；(2)生物体稀土元素内含量低，基体效应小，干扰因素少；(3)ICP-MS检出限低，灵敏度高；(4)针对不同片段DNA实现多元素标记。本专利技术利用DNA的碱基互配，金属探针与目标DNA(cfDNA)、生物素标记的捕获探针按照“三明治模型”进行杂交反应。利用链亲霉素对杂交反应后的产物进行捕获，通过生物素与链亲霉素反应，实现cfDNA的固定，洗去多余的金属探针，用硝酸消解的方式将稀土金属离子释放出来，通过ICP-MS对稀土金属离子进行定量分析，再用稀土金属离子定量DNA。本专利技术将ICP-MS分析方法和cfDNA检测通过金属探针联系在一起，可以准确定量特定序列核酸浓度。此外，本专利技术不需要对样品进行过多处理，一般情况下不需要核酸扩增即可检测，从采样到检测的用时较短；且本专利技术无需通过PCR扩增手段对样品中的特定序列的游离核酸进行定量，减少了PCR扩增所带来的如非特异扩增、得不到扩增产物等因素影响。优选地，所述捕获探针的3’端具有生物素标记。优选地，步骤S2-3.中，所述标准曲线中，标准品溶液的浓度范围为0.1-5.0pmol。本专利技术同时还保护所述检测方法在cfDNA定量检测中的应用。本专利技术所述检测方法还可用于液体活检，对比传统的组织活检存在创伤性和取材限制，液体活检在体液中检测生物标志物分子的技术方法作为临床检验新技术正逐步推广应用，本专利技术作为一种便捷、非侵入性的cfDNA检测方法，可实现多次取材，为开发可靠的、可重复的液体活检检测提供了新的方法。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种金属探针及其基于ICP-MS检测cfDNA的方法。本专利技术利用含有稀土金属的化合物标记DNA制备金属探针，通过ICP-MS对金属探针上金属定量，间接定量cfDNA。本专利技术可以对血浆或积液中提取出来的cfDNA特定片段进行检测，结合有较大线性范围的ICP-MS检测，实现浓度差距较大的样品同时检测，和对多种待测核酸同时检测，且检出限在现有方法的基础上大大降低，可以准确定量cfDNA到ng/L级别，方法简单高效，检测结果更加准确。附图说明图1为DNA-SH的LC-MS图；图2为DOTA-MMA-DNA的LC-MS图；图3为金属探针的LC-MS图；图4为本专利技术金属探针纯化后的色谱图；图5为本专利技术金属探针纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金属探针，其特征在于，所述金属探针中DNA-SH端上的-SH与螯合剂连接，螯合剂螯合稀土金属离子；/n其中，所述金属探针中DNA序列为5'-CGGACAAACTTCTTGGCGTAAA-3'。/n

【技术特征摘要】
1.一种金属探针，其特征在于，所述金属探针中DNA-SH端上的-SH与螯合剂连接，螯合剂螯合稀土金属离子；
其中，所述金属探针中DNA序列为5'-CGGACAAACTTCTTGGCGTAAA-3'。


2.一种权利要求1所述金属探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1-1.将巯基修饰的DNA与三(2-氯乙基)磷酸酯反应，还原二硫键，得到DNA-SH；
S1-2.加入螯合剂DOTA反应，得到螯合后的DNA-DOTA溶液；
S1-3.加入稀土金属离子溶液，与螯合后的DNA-DOTA溶液发生螯合反应，得到金属探针；
所述螯合剂DOTA的结构如式(I)所示：





3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1-3.中，所述稀土金属为铽、镧、铈或钆。


4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1-2.中，所述螯合剂DOTA与DNA-SH的摩尔比为10～20：1。


5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1-3.中，所述稀土金...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈莹莹，刘洪涛，许璐，刘利新，陈永明，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44