分枝杆菌的培养鉴定方法技术

本发明专利技术属于分枝杆菌培养鉴定技术领域，具体涉及一种分枝杆菌的培养鉴定方法。包括下述步骤：1)选择临床上萋‑尼氏染色阳性的痰标本，每份标本接种BD液体培基，进行BactecTM MGITTM 960液体培养；2)样本报阳时，利用细菌超声分散计数仪将分枝杆菌菌分散均匀记录原管浊度，继续孵育1‑3d；3)最后革兰氏染色确认有无杂菌进行MALDI‑TOF MS鉴定或者DNA微阵列芯片法鉴定。本申请的实施方案表明将MALDI‑TOF‑MS应用于临床微生物实验室进行分枝杆菌的常规鉴定是可行的，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
分枝杆菌的培养鉴定方法
本专利技术属于分枝杆菌培养鉴定
，具体涉及一种分枝杆菌的培养鉴定方法。
技术介绍
不同种分枝杆菌感染疾病的临床症状、影像学特征十分相似，但在致病性、药物敏感性、治疗方案上常截然不同，若无准确的病原学证据，可能会造成误诊，因此快速、准确到种甚至亚种的病原学鉴定对于分枝杆菌的确诊及治疗具有重要意义。当前国内外实验室主要采用液体、固体两种方法进行分枝杆菌的培养，固体培养既为传统的罗氏培养法，但是耗时较长，需4～6周。液体培养系统使用的自动化培养系统如BactecTMMGITTM960(BDDiagnostics,Sparks,Maryland,USA)，1～3周即可检测到分枝杆菌的生长，较传统的固体培养更为敏感和快速，但无法区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，仍需进一步进行鉴定。对于分枝杆菌的诊断，传统的生化鉴定方法操作复杂，影响因素多，耗时长，结果不准确，目前已不常使用，分子诊断技术主要是比较同源基因或序列差异的方法，由于方法复杂成本高在临床上较难常规开展。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDI-TOFMS)作为兴起的一种新的蛋白质组学检测技术，已广泛应用于临床常见细菌的鉴定，其鉴定原理是对微生物的核糖体蛋白组分析，从而形成不同的指纹图谱，区分微生物。核糖体蛋白提取的质量直接影响质谱鉴定结果，由于分枝杆菌细胞壁坚韧、脂质含量高，不易裂解获得足量蛋白质，因此标本需要前处理以获得足量的蛋白质，然而不同的前处理方法会影响到本方法的鉴别能力，应用MALDI-TOFMS检测分枝杆菌鉴定国内外虽有相关研究报道，但前处理方法多局限固体培养培养。现有的液体萃取方法并没有没有获得高的鉴定率，并且步骤繁杂，需要多次处理。此外，由于样本以及液体介质的潜在干扰，阳性菌量数较低等因素，从液体培养基中准确的鉴定分枝杆菌还是较为困难。可见应用MALDI-TOFMS直接鉴定BactecTMMGITTM960液体培养出的阳性培养物，主要有以下难点，一是从液体培基中如何获得足以进行鉴定的菌量；二是如何去除液体培基成分对菌体蛋白的影响；三是如何高质量的获得菌体的核糖体蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺点，提供一种分枝杆菌的鉴定方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种分枝杆菌的培养鉴定方法，包括下述步骤：1)选择临床上萋-尼氏染色阳性的痰标本，每份标本接种BD液体培基，进行BactecTMMGITTM960液体培养；2)样本报阳时，利用细菌超声分散计数仪将分枝杆菌菌分散均匀记录原管浊度，继续孵育1-3d；3)最后革兰氏染色确认有无杂菌进行MALDI-TOFMS鉴定或者DNA微阵列芯片法鉴定。优选的，步骤2)中继续孵育3d。优选的，步骤2)中孵育菌量浓度≥0.5麦氏单位。优选的，步骤3)的具体步骤为：a)将BactecTMMGITTM960分枝杆菌快速液体培养系统报阳的标本，利用细菌超声分散计数仪将分枝杆菌菌分散均匀记录原管浊度，取1.2mL培养液到1.5mLEppendorf管；b)离心2min，转速13000r/min，用移液枪小心吸弃上清液；c)加入300μL去离子水，置100℃金属浴30min；d)样本冷却后，加入900μL75％乙醇，充分混匀；e)离心2min，转速13000r/min，用移液枪小心吸弃上清液；f)沉淀中加入10μL的0.1～0.5mm氧化锆珠，加入纯乙腈至没过沉淀，漩涡震荡2min或超声破碎2min；g)加入与乙腈体积相同的70％甲酸溶液，涡旋震荡30s；h)13000r/min离心2min，取上清1μL滴加到质谱仪靶板上，并在室温下自然晾干；i)在上述样品点上覆盖1μLHCCA基质溶液，自然晾干后即可上机质谱鉴定。优选的，步骤f)中采用加入0.5mm氧化锆珠，加入纯乙腈至没过沉淀，超声破碎2min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：BactecTMMGITTM960自动液体培养检测系统灵敏度设置的理念是尽可能快地检测分枝杆菌的生长，因此，系统报阳时液体样品含有较少的菌量[7]，本研究结果显示将液体培养的阳性培养物继续孵育至少1d，菌量浓度≥0.5麦氏单位时，可获得可鉴定出的菌量。MGITTM960液体培养基的主要成分是荧光指示剂(固定在管底)和培养液，培养液包括5.9g/L改进的肉汤培养基和1.25g/L的酪蛋白胨，如直接将报阳的液体培养基进行加热灭活，培养基中的蛋白质成分可能会干扰菌体蛋白的提取，因此我们通过将报阳的液体培基转移部分培养液至离心管，经过离心处理后取沉淀和质谱级纯水洗涤的方式来去除液体培基可能对菌体蛋白的影响。分枝杆菌细胞壁坚韧、脂质含量高，所以要想提取分枝杆菌的核糖体蛋白必须充分破坏其细胞壁，因此我们通过0.1～0.5mm氧化锆珠超声破碎获得良好的鉴定结果。本专利技术实现了BactecTMMGITTM960液体培养阳性培养物的直接质谱鉴定，缩短了培养鉴定的时间，将分枝杆菌鉴定到种水平，能区分出结核菌与非结核菌，同时也能将与分枝杆菌相似的奴卡菌鉴定出来，对临床疾病的鉴别诊断起到了积极的作用。给临床早期诊断和治疗提供了有力的依据，减少了患者的经济负担和经验用药带来的副作用。质谱检测技术运用于临床对结核病患者提供了一种精准、快速的检测报告，同时高通量的微生物鉴定手段对实验室工作也起到了一个巨大的推动作用，广泛应用能助力结核病的快速诊断。与基因芯片的鉴定方法相比，本专利技术的MALDI-TOFMS分析一个样品大约需要1min，而整个样品完成鉴定只需要1～2h。每个样品的检测费用约为5元。如果使用大量的测试样品，MALDI-TOF质谱鉴定分枝杆菌所需的样品量小、简单、快速、准确、廉价。综上所述，将MALDI-TOF-MS应用于临床微生物实验室进行分枝杆菌的常规鉴定是可行的，具有良好的应用前景。附图说明：图1示出临床标本鉴定分枝杆菌质谱图。具体实施方式为了使本
的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本专利技术作进一步的详细说明。研究对象：本专利技术收集天津市海河医院2019年1月到2019年12月，MGIT960分枝杆菌快速液体培养仪机器报阳的阳性培养物，其中420例作为研究对象。试剂和仪器：甲酸、乙腈、基质和标准溶剂(美国BrukerDahonies公司)，MALDI.TOF靶板和AutoflexMALDI.TOF质谱仪(美国BrukerDahonies公司)，Flexcontrol3.0软件和Biotyper3.0软件(美国BrukerDahonics公司)，MALDISepsityperKit(美国BrukerDahonics公司)，超声震荡仪，0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分枝杆菌的培养鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤：/n1)选择临床上萋-尼氏染色阳性的痰标本，每份标本接种BD液体培基，进行BactecTMMGITTM 960液体培养；/n2)样本报阳时，利用细菌超声分散计数仪将分枝杆菌菌分散均匀记录原管浊度，继续孵育1-3d；/n3)最后革兰氏染色确认有无杂菌进行MALDI-TOF MS鉴定或者DNA微阵列芯片法鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种分枝杆菌的培养鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)选择临床上萋-尼氏染色阳性的痰标本，每份标本接种BD液体培基，进行BactecTMMGITTM960液体培养；
2)样本报阳时，利用细菌超声分散计数仪将分枝杆菌菌分散均匀记录原管浊度，继续孵育1-3d；
3)最后革兰氏染色确认有无杂菌进行MALDI-TOFMS鉴定或者DNA微阵列芯片法鉴定。


2.根据权利要求1所述的分枝杆菌的培养鉴定方法，其特征在于，步骤2)中继续孵育3d。


3.根据权利要求1所述的分枝杆菌的培养鉴定方法，其特征在于，步骤2)中孵育菌量浓度≥0.5麦氏单位。


4.根据权利要求1所述的分枝杆菌的培养鉴定方法，其特征在于，步骤2)中具体步骤为：步骤3)的具体步骤为：
a)将BactecTMMGITTM960分枝杆菌快速液体培养系统报阳的标本，利用细菌超声分散计数仪将分枝杆菌菌分散均匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱彧，秦中华，张丽霞，孙海柏，吴敏，李志媛，郭明日，冯冉冉，刘蕾，陶燕燕，
申请(专利权)人：天津市海河医院，
类型：发明
国别省市：天津;12