一种基于LFD-RMA法检测幽门螺杆菌的引物探针组制造技术

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于LFD

【技术实现步骤摘要】
一种基于LFD
‑
RMA法检测幽门螺杆菌的引物探针组


[0001]本申请属于生物检测
，具体为一种基于LFD
‑
RMA法检测幽门螺杆菌的引物探针组。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是一种革兰氏阴性杆菌，其生存能力极强，能够在胃中强酸性环境中生存，是目前发现的唯一能够在胃里面生存的细菌，人是它的唯一宿主和传染源。HP是消化性溃疡发生和治疗后复发的主要原因，它在十二指肠溃疡患者中检出率高达95％
‑
100％，胃溃疡患者中的检出率在70％以上。同时，HP可以引起胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生，被世界卫生组织明确列为Ⅰ类致癌物。HP在全世界各地的感染率各异，主要取决于人种差异、居住环境、卫生条件、经济状况、受教育程度、高危职业(医护人员)等因素，但总体感染人数庞大。我国成人感染率统计数字不一，但普遍认为在50％以上。大部分感染者是无症状的，只有在体检时做相关检查才能发现；少部分人会表现为消化不良的症状；10％
‑
20％的感染者会发生消化性溃疡；更少一些人会发生胃癌或胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤。因此快速准确地检测HP感染对大众健康具有重要意义。
[0003]目前幽门螺杆菌的检查主要有血清Hp抗体检测、尿素呼气实验、粪便幽门螺杆菌抗原检测和荧光定量PCR检测。其中血清抗体检验由于无法区分是既往感染还是正在感染，一般用于人群感染率的流行病学调查；粪便Hp抗原检测的普及度还不是很高；尿素呼气实验目前广泛用于临床上判断感染和治疗后的复查，但要检查前4周内停用或禁用抗生素、铋剂和抑酸药物，且易出现假阳性；荧光定量PCR方法灵敏高效，但费用高昂，不适合在基层医院推广普及。
[0004]而重组酶介导扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37
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42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现核酸的快速扩增。RMA技术可以与侧流免疫层析技术(LFD)相结合进行扩增产物的检测，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，仅使用侧流层析试纸就可以通过肉眼观察结果，因此可实现幽门螺杆菌的快速检测。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD
‑
RMA法检测幽门螺杆菌的引物探针组，本申请是通过下述方案实现的：
[0006]一种基于LFD
‑
RMA法检测幽门螺杆菌的引物探针组，包括检测幽门螺杆菌的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：
[0007]HP
‑
F：
[0008]5’‑
GGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGATGAA
‑3’
；
[0009]HP
‑
R：
[0010]5’‑
[Biotin]ATTGAGCAATATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTA
‑3’
；
[0011]HP
‑
P：
[0012]5’‑
[FAM]AGGCTATGACGGGTATCCGGCCTGAGAGGG[dSpacer]GAACGGACACACTGGA[C3
‑
spacer]‑3’
。
[0013]优选的，所述下游引物的5
’
端用Biotin标记；探针的5
’
端用FAM标记，第31个碱基T替换为THF(dSpacer)，3
’
末端被阻断基团C3
‑
spacer修饰；扩增产物大小不超过500bp。
[0014]一种基于LFD
‑
RMA法检测幽门螺杆菌的的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水、侧流层析检测试纸条。
[0015]优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括终浓度各10μM的RMA引物对及检测探针组、100ng/μL的大肠杆菌RecA蛋白、40ng/μL的UvsY蛋白、800ng/μL的单链结合蛋白GP32、60ng/μL的Bst聚合酶、80ng/μL的核酸内切酶IV。
[0016]优选的，所述醋酸镁的终浓度为100mM。
[0017]优选的，所述缓冲液包括下述组分：50mM的Tris、10％w/v的聚环氧乙烷、2mM的海藻糖、2.5mM的甘露醇、10mM的ATP、2mM的dNTPs、1000ng/mL的肌酸激酶和25mM的磷酸肌酸。
[0018]优选的，所述标准阳性质粒为含有HP基因片段的重组质粒，用于HP核酸检测的阳性对照。
[0019]优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
[0020]优选的，所述试剂盒可以检测的样品为唾液、牙斑、胃粘膜组织、胃液、肠液、粪便等。
[0021]一种基于LFD
‑
RMA法检测幽门螺杆菌的方法，包括以下步骤：
[0022](1)提取待测样本的DNA；
[0023](2)设计用于HP检测的引物对及探针；
[0024](3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的扩增反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应在恒温水浴锅中进行，反应条件为：40℃水浴5min后，混匀，再40℃水浴15min；
[0025](4)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测：当试纸条出现两条色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有HP；当试纸条只有质控区出现一条色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有HP。
[0026]有益效果：(1)操作方便，检测时间短，RMA扩增反应只需在30
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42℃下30min内即可完成，可用于HP感染的快速诊断；
[0027](2)将RMA和LFD技术相结合，既可以实现HP核酸的等温体外快速扩增，又可以实现检测结果的可视化，在无需特殊仪器设备下即可实现HP的快速检测；
[0028](3)检测样本可为唾液或粪便，样品采集无创且无痛，避免了胃镜等有创采样方法，因而能减少取样难度和取样痛苦，并且能节约检测时间和检测成本；
[0029](4)闭管检测，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LFD
‑
RMA法检测幽门螺杆菌的引物探针组，其特征在于，包括检测幽门螺杆菌的引物对及对应的探针，其中，引物和探针序列为：HP
‑
F：5
’‑
GGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGATGAA
‑3’
；HP
‑
R：5
’‑
[Biotin]ATTGAGCAATATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTA
‑3’
；HP
‑
P：5
’‑
[FAM]AGGCTATGACGGGTATCCGGCCTGAGAGGG[dSpacer]GAACGGACACACTGGA[C3
‑
spacer]
‑3’
。2.如权利要求1所述的一种基于LFD
‑
RMA法检测幽门螺杆菌的引物探针组，其特征在于，所述下游引物的5
’
端用Biotin标记；探针的5
’
端用FAM标记，第31个碱基T替换为THF(dSpacer)，3
’
末端被阻断基团C3

【专利技术属性】
技术研发人员：陈龙，陈大为，张瑶，
申请(专利权)人：济南国益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：