一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒。本方法首先将锁式探针和DNA模板连接形成带有茎环结构的长串联重复序列片段，然后将该产物和茎环引物、滚环引物、等温扩增引物混合在一起，构造双茎环扩增元件进行指数扩增，达到信号的指数放大。其中，锁式探针包括正常型锁式探针和突变型锁式探针，将突变位点设计在突变型锁式探针的3

【技术实现步骤摘要】
一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术，通过组合锁式探针和茎环引物，通过连接反应和扩增反应两步法从而检测双链DNA点突变，适合特异性点突变的检测。

技术介绍

[0002]点突变是基因突变的一种主要形式，特定点突变常会引起蛋白编码的错误，从而翻译出错误的蛋白质，这在某些疾病和病原微生物诊断中具有重要意义。如肺癌EGFR基因T790M突变使一代靶向药物特罗凯和易瑞沙失去作用，只有三代药物泰瑞莎起作用。
[0003]肺炎支原体是一种介于病毒和细菌之间的微生物，在5
‑
20岁年龄段人中最常见，可通过气溶胶微粒的形式传播，造成肺外各系统改变，目前医院中常见的检测手段主要是胶体金法。肺炎支原体23s rRNA结构域V区A2063G突变是肺炎支原体最常见的突变位点，该突变位点常常伴随着14环和15环抗生素失效，目前临床上诊断该耐药主要是药敏法，大约需要一至两天时间。如果不能很好的检测这些点突变，这些DNA点突变在临床上都会给与指导用药带来很大的麻烦，会造成药物无效以及耽误治疗黄金时间。根据常见点突变的检测结果可以在第一时间给与相应病情的病人更好的治疗方案。目前常用的点突变检测方法主要是基于电泳的方法和基于PCR扩增的方法。电泳方法操作要求可能更高，时间较长，不利于在医院推广。基于核酸的扩增方法操作简单，可通过制成试剂盒进行操作，集成化能更高。核酸扩增检测点突变的方法使用较多的有BEAMing PCR以及ARMS扩增阻滞系统。BEAMing PCR是首先通过磁珠加上引物，然后进行油包水PCR，收集磁珠，通过对突变模板和正常模板设计不同的探针，杂交后读取荧光，从而判读出突变比例。这种方法结果准确，操作要求高，适合伴随诊断。ARMS扩增阻滞系统是在突变位点设计一条引物，使其3
’
端末端和突变位点互补，这样可以很好的区分开来正常模板和突变模板，其技术的核心是特异性引物的筛选。这种方法操作相对简单，但对模板序列要求较高，结果准确率不是很高。
[0004]上述方法都需要繁锁的步骤、复杂的仪器设备以及长时间的诊断步骤，因此亟需一种操作简便、高效快捷、低成本的DNA点突变检测方法，以解决上述问题。
[0005]锁式探针检测是锁式探针的5
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端和3
’
端会分别和模板链互补，通过连接酶或者扩增酶来补齐缺口，形成完整环状单链，其5
’
端和3
’
端连接臂对于序列的要求不高，且模板序列的碱基长度可控范围大。添加环上引物和第二链引物可以分别进行线性扩增和指数扩增，或者是进行多线性和指数扩增是一种很好的检测方法。茎环结构是环引物扩增的核心元件，可以作为很多扩增方法的媒介。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒，以解决现有技术中步骤繁琐、仪器复杂且检测时间长的问题。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，具体包括以下：
[0009]一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010]S1，提供DNA模板以及突变型锁式探针，通过连接酶连接，获得环化产物；所述的突变型锁式探针的序列为5
’
连接臂
‑
第一功能区
‑
第二功能区
‑
第三功能区
‑3’
连接臂，所述的5
’
连接臂和3
’
连接臂与DNA模板互补，且DNA点突变位点设计在锁式探针的3
’
末端；
[0011]S2，加入滚环引物，与S1中所述的环化产物结合，进行滚环扩增，获得带有茎环结构的长串联重复序列片段；所述的滚环引物5
’‑3’
端的序列依次为：第一功能区，以及与第二功能区反向互补序列；
[0012]S3，加入茎环引物，与S2得到的所述的带有茎环结构的长串联重复序列片段结合，延伸得到双茎环结构产物；所述的茎环引物包含3
’
突出端，且3
’
突出端的序列与所述的第三功能区相同；
[0013]S4，利用环介导等温扩增技术扩增S3得到的所述的双茎环结构产物，并进行检测分析。
[0014]优选地，所述的方法还包括对所述DNA模板的质量进行检测，具体包括：提供正常型锁式探针，进行步骤S1、S2、S3、S4，对得到的扩增产物进行检测；所述的正常型锁式探针的序列为5
’
连接臂
‑
第一功能区
‑
第二功能区
‑
第三功能区
‑3’
连接臂，其中5
’
连接臂和3
’
连接臂设计在DNA模板的非突变位点区且与该区互补，所述的第一功能区
‑
第二功能区
‑
第三功能区与所述的突变型探针的该些序列相同。
[0015]优选地，所述的正常型锁式探针和突变型锁式探针的5
’
连接臂长度为10
‑
20bp，3
’
连接臂长度为15
‑
25bp，第一功能区长度为10
‑
20bp，第二功能区长度为15
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30bp，第三功能区长度为20
‑
40bp。
[0016]优选地，所述的S1反应条件为：65℃、10min或95℃、5min预加热，95℃、30s到65℃，5min共10个循环，再95℃、5min。
[0017]优选地，所述的S4反应过程采用荧光染色法进行检测分析。
[0018]本专利技术的第二个目的是提供采用上述方法检测点突变的试剂盒，该试剂盒包含：所述的突变型锁式探针、正常型锁式探针、滚环引物、茎环引物和等温扩增引物，所述的等温扩增引物和滚环引物一起用于扩增所述的双茎环结构产物，得到指数扩增产物。
[0019]优选地，所述的正常型锁式探针、突变型锁式探针的使用浓度为1nM
‑
100nM。
[0020]优选地，所述的滚环引物的使用浓度为0.5μM
‑
1.5μM，茎环引物的使用浓度为50nM
‑
150nM，等温扩增引物的使用浓度为0.5μM
‑
1.5μM。
[0021]进一步地，所述的试剂盒用于检测肺炎支原体A2063G点突变，所述的突变型锁式探针序列为：5
’‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张童，隋国栋，赵望，赵伟，戴瑞雪，刘思秀，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：