一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法及其在宫颈癌血清生物标志物检测的应用技术

一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法及其在宫颈癌血清生物标志物检测的应用，该免疫传感器不仅具有良好的特异性识别性能，而且具有低检测极限和良好的重复性。将其成功应用于健康受试者、CIN 1、CIN 2、CIN 3及宫颈癌患者血清中survivin和OPN的检测，并通过ELISA验证了检测结果的可靠性。总之，这种敏感的SERS免疫传感器在宫颈癌早期筛查中具有广阔的应用前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法及其在宫颈癌血清生物标志物检测的应用


[0001]本专利技术涉及一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法及其在宫颈癌血清生物标志物检测的应用，属于宫颈癌检测


技术介绍

[0002]宫颈癌是最常见的妇科癌症之一，对妇女的健康构成了严重威胁。宫颈癌的早期筛查和准确诊断与有效治疗密切相关，从而提高患者的生存率。但是，在早期阶段，没有典型临床症状的宫颈癌患者很难被诊断。因此，迫切需要具有高灵敏度和特异性的用于早期筛查的新型诊断工具。如今，检测技术已经取得了长足的进步，监测肿瘤标志物的变化可以筛查和诊断癌症。生存素(survivin)是凋亡蛋白家族的成员，它不仅抑制肿瘤细胞凋亡，而且还促进其增殖和侵袭的能力。骨桥蛋白(OPN)是一种分泌的糖蛋白，在各种生理和病理过程(包括肿瘤的发生和发展)中起着重要的作用。根据survivin和OPN的生物学特性，它们的血清水平在肿瘤发生过程中会发生变化，可以被认为是肿瘤筛查和诊断的生物标志物。
[0003]目前，已开发出酶联免疫吸附试验(ELISA)、比色法、化学发光免疫测定(CLIA)和局部表面等离振子共振(LSPR)来检测肿瘤标志物。尽管这些方法具有一些优势，但高成本，费时和复杂的反应条件限制了它们的临床应用。表面增强拉曼散射(SERS)是一种方便，快速且超灵敏的传感技术，由于其独特的光谱指纹图谱，在单分子水平上的高选择性和灵敏性，已被广泛用于生物标志物的定量分析。特别地，窄线宽的SERS光谱特征峰有利于同时采集不同被分析物的信号，提高检测效率并节省检测成本。Yang的小组报告了基于SERS的免疫测定的实际应用，该测定实现了对铁蛋白抗原的定量检测。Ma等研究人员开发了由Fe3O4@TiO2@Ag核壳纳米粒子探针和金纳米线底物组成的SERS免疫结构，用于检测癌症患者血清样品中的PSA和AFP，结果精确至pg/mL。这些表明，SERS技术在检测生物标志物方面非常有前途。
[0004]拉曼信号的大幅增强是SERS技术实现高灵敏度检测的关键。目前，人们普遍认为SERS信号的放大是由于等离子体纳米材料表面等离子体共振(SPR)激发的局域电磁场增强。电磁场最强的区域称为“热点”。金属纳米颗粒之间的纳米级间隙形成强的局部电磁场，这对于获得SERS“热点”特别有益。为了获得高密度的“热点”，研究人员已经将各种形态的纳米材料组装到基底中。这些SERS基底主要分为：无序或高度有序。可重复性是定量检测方法的另一个重要因素。与无序的SERS基底相比，高度有序的SERS基底由于其出色的信号均匀性和可重复性而保证了数据的可靠性。此外，与无机物质(抗生素，农药等)的检测相比，生物标志物的检测对SERS底物的生物传感活性还有其他要求。SiO2微球和金纳米颗粒(AuNPs)具有成本低，制备简单和生物相容性高的优点。通过将它们组装成有序的SERS底物，不仅增加了“热点”的密度，而且还促进了免疫活性蛋白的进一步功能化。SERS探针的特异性得益于拉曼报告分子的独特指纹图谱，这使SERS技术可以实现对不同分析物的同时分析。Au
‑
Ag纳米壳(Au
‑
AgNSs)是空心无孔球形结构，内表面和外表面均具有SPR效应，这有利
于增强表面电磁场并显示出优异的SERS性能。此外，Au
‑
Ag合金结构的化学稳定性可确保其SERS活性。Au
‑
AgNSs在SERS探针的制备中具有很高的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对上述现有技术的不足，提供基于高密度热点Au@SiO2阵列基底和Au
‑
Ag纳米壳探针的SERS免疫传感器及其在宫颈癌血清生物标志物的超灵敏检测的应用。
[0006]本专利技术通过使用AuNPs@SiO2微球(Au@SiO2)阵列免疫基底和两种Au
‑
AgNSs免疫探针，开发了一种新型SERS免疫传感器，用于临床血清中survivin和OPN的超灵敏检测(图1)。在制备Au@SiO2阵列基底的过程中，使用Langmuir
‑
Blodgett(LB)方法获得单层SiO2微球阵列，然后用油水界面自组装法在SiO2微球表面覆盖单层AuNPs膜。通过有限差分时域(FDTD)模拟了基底的增强电磁场。SiO2微球表面上的电磁场以及相邻微球之间的间隙均得到增强，这证明Au@SiO2阵列基底具有高密度“热点”。4
‑
氨基苯硫酚(4
‑
ATP)和5,5'
‑
二硫代双
‑
(2
‑
硝基苯甲酸)(DTNB)的拉曼峰很容易区分，因此选择它们来制备两个探针。它们不仅可以通过
‑
SH键抓住Au
‑
AgNS，而且还可以通过形成酰胺键与抗体结合。将抗survivin抗体和抗OPN抗体与Au@SiO2阵列底物和Au
‑
AgNSs连接后，制成了由免疫探针和免疫底物组成的SERS免疫传感器。
[0007]在survivin和OPN被免疫底物捕获后，添加了两个免疫探针，用于形成夹心免疫复合物。接下来，通过监测免疫传感器的SERS信号强度对这些生物标志物进行定量分析。它表现出良好的重现性，出色的灵敏度和低检测限。最后，对健康受试者和宫颈上皮内瘤样变1(CIN 1)，CIN 2，CIN 3和子宫颈癌患者血清中的survivin和OPN进行了检测，取得了与ELISA一致的结果。可想而知，这种极具吸引力的SERS免疫传感器在宫颈癌早期诊断中具有出色的临床应用。
[0008]具体的，本专利技术SERS免疫传感器的制备方法如下：
[0009]步骤1)血液样本的采集和处理：
[0010]血清样本分为健康人群、CIN 1、CIN 2、CIN 3和宫颈癌患者五组，在早餐前抽取5mL静脉血，在4℃下3000r/min转速离心处理10min之后，将获得的血清样本保存在
‑
80℃下。
[0011]步骤2)免疫基底的制备：
[0012]2.1)AuNPs的合成
[0013]首先，将25mL 1mM的HAuCl4溶液加入100mL双口烧瓶中，加热至沸腾；随后逐滴加入4mL 38mM的二水合柠檬酸三钠水溶液，在100℃下700r/min转速剧烈搅拌15min后，溶液的颜色从浅黄色变为酒红色；最后待溶液自然冷却至室温后，AuNPs溶液制备完成；
[0014]2.2)SiO2微球的合成
[0015]遵循溶胶
‑
凝胶法合成SiO2微球；将10mL氢氧化铵、50mL乙醇与6mL超纯水混合并加热至30℃；然后将10mL原硅酸乙酯滴加到该混合溶液中，溶液的颜色逐渐变成乳白色；反应12h后，制备了SiO2微球；最后，通过在4000r/min转速下离心10min除去未反应的原料，并将它们分散在甲醇溶液中以制备浓度为5wt％的SiO2微球的悬浮液；
[0016]2.3)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法，其特征是，在制备Au@SiO2阵列基底的过程中，使用Langmuir
‑
Blodgett方法获得单层SiO2微球阵列，然后用油水界面自组装法在SiO2微球表面覆盖单层AuNPs；通过有限差分时域模拟基底的增强电磁场；SiO2微球表面上的电磁场以及相邻微球之间的间隙均得到增强，证明Au@SiO2阵列基底具有高密度“热点”；4
‑
氨基苯硫酚(4
‑
ATP)和5,5'
‑
二硫代双
‑
(2
‑
硝基苯甲酸)(DTNB)的拉曼峰很容易区分，选择它们来制备两个探针，它们不仅可以通过
‑
SH键抓住Au
‑
AgNS，而且还可以通过形成酰胺键与抗体结合；将抗survivin抗体和抗OPN抗体与Au@SiO2阵列基底和Au
‑
AgNSs连接后，制成了由免疫基底和免疫探针组成的SERS免疫传感器。2.根据权利要求1所述的一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法，其特征是，包括：1)血液样本的采集和处理；2)免疫基底的制备；2.1)AuNPs的合成；2.2)SiO2微球的合成；2.3)亲水硅片的制备；2.4)单层SiO2微球阵列的制备；2.5)Au@SiO2阵列基底的制备；2.6)抗survivin抗体和抗OPN抗体偶联的Au@SiO2阵列基底的制备；3)Au
‑
AgNS的合成；4)Au
‑
AgNSs免疫探针的制备。3.根据权利要求2所述的一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法，其特征是，步骤1)血液样本的采集和处理：血清样本分为健康人群、CIN 1、CIN 2、CIN 3和宫颈癌患者五组，在早餐前抽取5mL静脉血，在4℃下3000r/min转速离心处理10min之后，将获得的血清样本保存在
‑
80℃下。4.根据权利要求3所述的一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法，其特征是，步骤2)免疫基底的制备：2.1)AuNPs的合成首先，将25mL 1mM的HAuCl4溶液加入100mL双口烧瓶中，加热至沸腾；随后逐滴加入4mL 38mM的二水合柠檬酸三钠水溶液，在100℃下700r/min转速剧烈搅拌15min后，溶液的颜色从浅黄色变为酒红色；最后待溶液自然冷却至室温后，AuNPs溶液制备完成；2.2)SiO2微球的合成遵循溶胶
‑
凝胶法合成SiO2微球；将10mL氢氧化铵、50mL乙醇与6mL超纯水混合并加热至30℃；然后将10mL原硅酸乙酯滴加到该混合溶液中，溶液的颜色逐渐变成乳白色；反应12h后，制备了SiO2微球；最后，通过在4000r/min转速下离心10min除去未反应的原料，并将它们分散在甲醇溶液中以制备浓度为5wt％的SiO2微球的悬浮液；2.3)亲水硅片的制备用食人鱼溶液处理硅片以获得亲水硅片；将过氧化氢以3:7的体积比加入浓硫酸中以制备食人鱼溶液；然后，将硅片切成10
×
15mm的小片，浸入食人鱼溶液中30min，然后用超纯水和无水乙醇超声清洗3次；2.4)单层SiO2微球阵列的制备
单层SiO2微球阵列是通过Langmuir
‑
Bloadgate气液界面组装方法制造的；将氯仿以2:3的体积比添加到微球悬浮液中，然后每次取5μL SiO2微球悬浮液滴在水面上；SiO2微球自发地在水表面扩散，直至覆盖整个水面；接下来，通过将100μL的2wt％的SDS水溶液滴到水面上，形成了紧密排列的SiO2微球单层阵列，然后将其转移到干净的亲水硅片上；最后，将单层SiO2微球阵列硅片干燥以进一步使用；2.5)Au@SiO2阵列基底的制备首先，将4mL AuNPs胶体溶液和2mL己烷依次加入到烧杯中，然后逐滴添加2mL乙醇；加入乙醇后，AuNPs在油水界面形成金属光泽的薄膜；其次，利用组装好的单层SiO2微球阵列硅片拾取Au膜，干燥后得到Au@SiO2阵列基底，其底部具有单层SiO2微球阵列结构，顶部具有紧密堆积的单层AuNPs；2.6)抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢丹，曹小卫，冉梦林，刘依帆，史宏灿，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：