一种基于核苷酸适配体的金属探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于核苷酸适配体的金属探针及其制备方法和应用，涉及生物检测技术领域。该探针由

【技术实现步骤摘要】
一种基于核苷酸适配体的金属探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种基于核酸适配体的金属探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]单细胞质谱成像技术(IMC)主要通过使用镧系金属同位素标记抗体(Antibody,Ab)，用质谱代替光谱作为检测方式，具有超低背景、通道间无干扰、多参数检测等完全区别于传统模式的优势特点。IMC技术具有应用方便，标记靶点多样，通量高等优点，在疾病诊疗、药物研发以及生物学基础研究等领域发挥着重要作用。与以前的组织分析方法相比，多通道IMC成像技术可以全面了解组织成分和生物标志物含量分布。现代医学研究需要对细胞或组织成像进行高维灵敏的多组分分析，以探究潜在疾病的复杂生物学机制。
[0003]目前IMC技术中的金属标签是由Fluidigm公司研发的聚合物基镧系金属螯合物(lanthanide metal
‑
chelating polymers,MCPs(Ln))的金属试剂盒，探针是传统的具有优异识别性能的Ab。由于Ab存在着价格昂贵、稳定性差和重现性差等明显的缺点。因此，寻找IMC技术中新的小分子生物探针不仅具有重要的科学意义，而且具有巨大的经济价值。
[0004]核苷酸适配体(Aptamer)通常是通过一个称为配体系统进化的过程，即通过指数扩增技术(SELEX)在体外产生的能够与目标抗原高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸，长度从15到100个核苷酸不等。Aptamer的核苷酸序列决定了其与目标分子特异性结合的三维结构。另外，它能对无机离子、有机小分子、多肽、蛋白、细菌、病毒和细胞等进行专一识别。与Ab比较，Aptamer具有合成容易、稳定性好和价格低廉的优势，筛选能识别特定蛋白或其特定结构域的Aptamer应用于组学分析、疾病诊断和信号通路调控等领域。Aptamer能够特异性地结合细胞表面标记物，已被用于开发多效价抗体类似物和荧光流式细胞仪分析。Zhang等筛选出的荧光标记的特异结合人CD30蛋白的RNA基Aptamer，通过流式细胞仪检测后结果显示:低浓度(0.3nM)的Aptamer就能特异地、敏感地检测到淋巴细胞上表达CD30抗原，与临床公认的诊断探针
‑
Ab探针效果一样，从而认为该Aptamer可作为检测表达CD30的探针。Tan等通过cell
‑
SELEX技术筛选得到针对过表达人表皮生长因子受体III型突变体的人脑胶质瘤细胞(U87
‑
EGFRvIII)的Aptamer，其中一条序列与靶细胞共孵育时能定位于细胞核。经“pull
‑
down”实验表明，该Aptamer能识别EGFRvIII蛋白，实验者推测，可能是由于Aptamer结合在EGFRvIII蛋白上，由于该蛋白介导的内吞作用而进入细胞，为细胞核靶向输送提供了颇有前景的分子工具。Yang课题组筛选出能够特异性识别肿瘤细胞上过表达的上皮细胞粘附分子(EpCAM)的Aptamer，可用于肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞捕获，此外他们还对筛选得到的Aptamer进行序列优化，经过优化的Aptamer
‑
SYL3C对乳腺癌细胞MDA
‑
MB
‑
231细胞系和胃癌细胞Kato III细胞系识别解离常数分别为(38
±
9)nmol/L和(67
±
8)nmol/L。其富集肿瘤细胞的效率达到63％，捕获后细胞的纯度为80％,可用于血液中肿瘤细胞的检测。Aptamer
‑
AX102能够特异性靶向血管新生中的特定蛋白血小板源生长因子B(PDGF
‑
B)，有利于捕捉癌细胞发生发展的过程。
[0005]另一方面，传统免疫染色技术的一抗二抗复合物可达25nm长，空间位阻可能导致标记密度低。因此，小探针有望提高生物样品的染色准确性。最近，有研究表明，在超分辨显微镜下，小的单域抗体(single domain antibody，sdAb或纳米体)能够将荧光分子定位到更接近预定目标的位置，从而提高了与传统抗体染色相比的更佳的定位准确性。同样，Aptamer也被认为是在超分辨显微镜领域具有相当优势的另一种小探针，因此，Aptamer探针的应用对提高多通道IMC的蛋白分子的精准定位具有重要意义。前列腺癌上皮细胞特异性跨膜蛋白PSMA是一种著名的跨膜糖蛋白，过表达于前列腺上皮细胞，通常作为PaC诊断和患者治疗的标志物。为了靶向PSMA，早期从合成的RNA适配体文库中筛选出的Aptamer由79个核苷酸组成的A10和A9，但长序列的高分子量的Aptamer的靶向性受到了一定的限制。在后续的实验中，研究人员不断缩短其序列，最终开发出仅有37个核苷酸碱基的A10
‑
3.2适配体分子，A10
‑
3.2的分子量明显降低，且与PSMA的结合亲和力仍保持良好，其平衡解离常数(K
D
)为2.9nM。
[0006]因此，本领域的技术人员致力于开发一种高灵敏度、精准定位并且能提高生物样品的染色准确性的价格低廉的IMC探针。

技术实现思路

[0007]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是开发一种高灵敏度、精准定位并且能提高生物样品的染色准确性的价格低廉的IMC探针。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种基于核酸适配体的金属探针，即MCPs(Ln)与特异性靶向抗原的Aptamer进行偶联反应制备镧系金属标记的Aptamer探针。本专利技术将亲和识别替代免疫识别，将Aptamer替代Ab，设计合成一种基于MCPs(Ln)的Aptamer探针，并用IMC技术验证金属标记的Aptamer探针结合细胞或组织中靶标物质的靶向性和灵敏性能力；后续计划结合IMC多通道检测，旨在建立一种高通量、高灵敏度、精准定位的IMC新技术，为细胞系或组织的蛋白质的定量、定位分析提供新的手段和方法，建立亚细胞水平的关键信号通路蛋白和蛋白质复合物的测定方法，该工作可望为精准药效评价和个性化药物筛选等重要应用提供科学可靠的依据。
[0009]本专利技术提供一种基于核苷酸适配体的金属探针，包括由
167
Er金属阳离子、双功能聚合物和
‑
SHC6‑
A10
‑
3.2适配体组成的金属标记的Aptamer探针。
[0010]进一步地，双功能聚合物的第一末端为三胺五乙酸DTPA；其第二末端为马来酰亚胺功能基团。
[0011]本专利技术还提供一种基于核苷酸适配体的金属探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012]步骤1、制备聚合物基镧系金属螯合物，利用双功能聚合物中第一末端中的三胺五乙酸DTPA基团螯合
167
Er阳离子生成聚合物基
167
Er镧系金属螯合物MCPs(
167
Er)；
[0013]步骤2、
‑
SHC6‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核苷酸适配体的金属探针，其特征在于，所述金属探针包括由
167
Er金属阳离子、双功能聚合物和
‑
SHC6‑
A10
‑
3.2适配体组成的金属标记的核苷酸适配体Aptamer探针。2.如权利要求1所述的一种基于核苷酸适配体的金属探针，其特征在于，所述双功能聚合物的第一末端为三胺五乙酸DTPA；其第二末端为马来酰亚胺功能基团。3.一种基于核苷酸适配体的金属探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、制备聚合物基镧系金属螯合物，利用双功能聚合物中第一末端中的三胺五乙酸DTPA基团螯合
167
Er阳离子生成聚合物基
167
Er镧系金属螯合物MCPs(
167
Er)；步骤2、
‑
SHC6‑
A10
‑
3.2适配体中加入磷酸三氯乙酯TCEP，得到暴露巯基的
‑
SHC6‑
A10
‑
3.2适配体，其中，所述磷酸三氯乙酯TCEP进一步还原了二硫键，所述二硫键是所述
‑
SHC6‑
A10
‑
3.2适配体放置过程中形成的；步骤3、将步骤1获得的聚合物基
167
Er镧系金属螯合物MCPs(
167
Er)与步骤2获得的暴露巯基的
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：丁显廷，余友谊，党婧琪，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：