一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法。通过采集华北豹的粪便样品，利用乙醇加热法、甲醇加热法和乙醇蒸馏水法提取雌二醇(E2)和孕酮(P)，并结合放射免疫分析法测得两者的含量，结果表明乙醇加热法是用于提取雌二醇和孕酮的最佳方法。本发明专利技术采用非损伤采样方法，采集华北豹的粪便样品，既省时又省力，还降低了采集样品的成本。有效的避免了捕捉、麻醉或静脉穿刺而使华北豹产生应激反应，确保了华北豹在自然状态下的激素分泌水平，确保了实验数据的准确性和可靠性。实验数据的准确性和可靠性。

【技术实现步骤摘要】
一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法


[0001]本专利技术涉及生物
，属于一种激素的提取方法，具体为一种华北豹 粪便类固醇激素的提取方法。

技术介绍

[0002]类固醇激素(Steroidhormone)是一类脂溶性激素，它们在结构上都是环戊烷 多氢菲衍生物。类固醇激素的分子质量较小，且是脂溶性的，可通过扩散或载 体转运进入靶细胞，激素进入细胞后先与胞浆内的受体结合。类固醇激素具有 极重要的医药价值；在维持生命、调节性功能，对机体发展、免疫调节、皮肤 疾病治疗及生育控制方面有明确的作用。
[0003]采用非损伤采样方法，采集华北豹的粪便样品。利用粪便样品提取生殖激 素代替血液样品提取生殖激素，具有很多其自身的优点：
[0004]一、有效的避免捕捉、麻醉或静脉穿刺而使动物产生应激反应，确保了动 物在自然状态下的激素分泌水平，减少对动物的伤害，同时确保了实验数据的 准确性和可靠性；
[0005]二、粪便样本采集过程既省时又省力，可以降低采集样品的成本。

技术实现思路

[0006]针对上述问题本专利技术提供了一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0008]本专利技术提供一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法：
[0009](1)所述类固醇激素包括雌二醇和孕酮；
[0010](2)所述雌二醇和孕酮提取的最佳方法为乙醇加热法，具体包括以下步骤：
[0011]步骤1，称取1g粪便加入10mL体积百分比浓度为80％的乙醇溶液中；
[0012]步骤2，在70℃水浴振荡15min后，冷却至4℃，4 000rpm/min离心15min， 取上清液；
[0013]步骤3，残渣加入5mL体积百分比浓度为80％的乙醇溶液重新悬浮，涡旋 震荡1min，3 000rpm/min离心15min，取上清液；
[0014]步骤4，合并步骤2和步骤3所得的上清液，经60℃水浴空气吹干；
[0015]步骤5，加1mL 0.05mol/L的PBS溶液复溶，
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20℃保存，备检。
[0016](3)所述雌二醇和孕酮提取的方法还包括甲醇加热法和乙醇蒸馏水法。
[0017]进一步，所述用于雌二醇和孕酮提取的甲醇加热法，包括以下步骤：
[0018](1)称取1g粪便加入10mL体积百分比浓度为90％的甲醇溶液；
[0019](2)在涡旋震荡仪上充分震荡1min，置于60℃的恒温水浴锅中温浴20 min；
[0020](3)4 000rpm/min离心10min，取上清液，置于
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20℃下保存，备检。
[0021]进一步，所述用于雌二醇和孕酮提取的乙醇蒸馏水法，包括以下步骤：
[0022](1)称取1g粪便加入10mL体积百分比浓度为90％的甲醇中；
[0023](2)超声波振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液；
[0024](3)加入2mL乙醇，超声波振荡30min，3 000r/min离心10min，取上 清液；
[0025](4)合并步骤(2)和步骤(3)的上清液，37℃水浴蒸发干燥；
[0026](5)依次缓慢加入3mL甲醇、1mL蒸馏水、2mL乙醚，静置30min， 此时溶液分成上下两层。
[0027](6)从下层中取2mL溶液，37℃水浴蒸发干燥后，加入1mL 0.05mol/L 的PBS缓冲液，37℃水浴振荡30min，置于
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20℃下保存，备检。
[0028]与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
[0029]本专利技术采用非损伤采样方法，既省时又省力，还降低了采集样品的成本。 有效的避免了捕捉、麻醉或静脉穿刺而使华北豹产生应激反应，确保了华北豹 在自然状态下的激素分泌水平，确保了实验数据的准确性和可靠性；本专利技术提 供的乙醇加热法、甲醇加热法和乙醇蒸馏水法操作简便，均可实现一次同时提 取雌二醇(E2)和孕酮(P)，提取效率高，使用最佳的提取方法
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乙醇加热法测 得雌二醇的含量为7 660.25
±
1 546.11pg/mL，孕酮的含量为3.26
±
0.35ng/mL。
具体实施方式
[0030]下面结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行具体、详细的 说明。
[0031]实施例1
[0032]乙醇加热法(Ethanol
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heating method)提取华北豹粪便类固醇激素
[0033](1)用电子秤称取1g华北豹粪便于离心管中，加入10mL体积百分比浓 度为80％的乙醇；
[0034](2)然后在70℃振荡水浴15min，之后，冷却至4℃，离心(4 000rpm/min， 15min)，取上清液至玻璃试管中；
[0035](3)残渣继续加入5mL体积百分比浓度为80％乙醇重新悬浮，涡旋震荡 1min后，离心(3 000rpm/min，15min)，取上清至玻璃试管中；
[0036](4)合并(2)和(3)的上清液，将含有乙醇的上清液60℃水浴空气吹干；
[0037](5)加1mL0.05 mol/L的PBS复溶，
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20℃保存，备检。
[0038]实施例2
[0039]甲醇加热法(Carbinol
‑
heating method)提取华北豹粪便类固醇激素
[0040](1)用电子秤称取1g粪便于离心管中，加入体积百分比浓度为90％的甲 醇10mL；
[0041](2)在涡旋震荡仪上充分震荡1min，置于60℃的恒温水浴锅中温浴20 min；
[0042](3)之后在离心机中以4 000rpm/min离心10min，取上清液于新的离心管 中，置于
‑
20℃下保存，备检。
[0043]实施例3
[0044]乙醇蒸馏水法(Ethanol
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distilled
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water method)提取华北豹粪便类固醇激素
[0045](1)用电子秤称取1g粪便于离心管中，加入体积百分比浓度为90％的甲 醇10mL；
[0046](2)超声波振荡30min，离心(3000rpm/min，10min)，取3mL上清液；
[0047](3)再加入2mL乙醇，超声波振荡30min，离心(3 000rpm/min，10min)， 取3mL上清液；
[0048](4)合并两次上清液置玻璃瓶中，37℃水浴蒸发干燥。
[0049](5)然后向玻璃瓶中依次缓慢加入3mL甲醇、1mL蒸馏水、2mL乙醚， 静置30min，此时溶液分成上下两层。
[0050](6)从下层中取2mL溶液，37℃水浴蒸发干燥后，加入0.05mol/L的PBS 缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法，其特征在于：(1)所述类固醇激素包括雌二醇和孕酮；(2)所述雌二醇和孕酮提取的最佳方法为乙醇加热法，具体包括以下步骤：步骤1，称取1g粪便加入10mL体积百分比浓度为80％的乙醇溶液中；步骤2，在70℃水浴振荡15min后，冷却至4℃，4 000rpm/min离心15min，取上清液；步骤3，残渣加入5mL体积百分比浓度为80％的乙醇溶液重新悬浮，涡旋震荡1min，3 000rpm/min离心15min，取上清液；步骤4，合并步骤(2)和步骤(3)所得的上清液，经60℃水浴空气吹干；步骤5，加1mL 0.05mol/L的PBS溶液复溶，
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20℃保存，备检。(3)所述雌二醇和孕酮提取的方法还包括甲醇加热法和乙醇蒸馏水法。2.根据权利要求1所述的一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法，其特征在于，所述用于雌二醇和孕酮提取的甲醇加热法，包括以下步骤：(1)称取1g粪便加入10mL体积百分比浓度为90％的甲醇溶液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亮亮，由玉岩，刘爱香，张卓，刘学锋，张成林，李晓光，
申请(专利权)人：北京动物园，
类型：发明
国别省市：