鉴别非平胸鸟性别的方法与所用成套试剂技术

本发明专利技术公开了鉴别非平胸鸟性别的方法与所用成套试剂。本发明专利技术公开的鉴别非平胸鸟性别的方法包括：以待测非平胸鸟的基因组DNA为模板，利用成套试剂进行实时荧光定量PCR，根据实时荧光定量PCR的熔解曲线判定待测非平胸鸟的性别：如待测非平胸鸟的熔解曲线含有两个特异峰，且溶解度峰值在0.2-0.4之间无峰或有低值峰，待测非平胸鸟为或候选为雌性；如待测非平胸鸟的熔解曲线含有一个特异峰，且溶解度峰值在0.2-0.4之间无峰或有低值峰，待测非平胸鸟为或候选为雄性；成套试剂由序列表中序列1、2、3和4所示的四种单链DNA组成。本发明专利技术的方法与成套试剂具有高灵敏度、特异性、准确性，具有广泛的应用前景。泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
鉴别非平胸鸟性别的方法与所用成套试剂


[0001]本专利技术涉及生物
中，鉴别非平胸鸟性别的方法与所用成套试剂。

技术介绍

[0002]鹤类是中国重点保护动物，为单态性鸟，很难通过外观和形态来进行性别鉴定，给人工繁殖造成很大困难，因此对其性别的快速鉴别对鹤类的繁殖具有重要的意义。
[0003]目前对鹤类性别的鉴别常利用PCR的方法进行，但是普通PCR方法虽然具有相对较高的特异性，然而都具有一个严重的缺陷，即需要通过两轮PCR扩增，也就是需要同时做两管PCR扩增或开管取产物进行第二轮扩增，并且都需要进行配制琼脂糖凝胶电泳。正是由于PCR扩增具有较高特异性，因此极易受到污染产生假阳性结果。开管进行两轮PCR反应、配制琼脂糖凝胶等步骤又大大增加了待检测样品收到污染的可能性。另外，上述方法需要使用到具有严重毒性的DNA染料，并不利于环保。因此，目前急需一种快速、准确性高的鉴别非平胸鸟性别的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何鉴别非平胸鸟的性别。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了鉴别或辅助鉴别非平胸鸟性别的方法，所述方法包括：以待测非平胸鸟的基因组DNA为模板，利用成套试剂进行实时荧光定量PCR，根据实时荧光定量PCR的熔解曲线判定待测非平胸鸟的性别：如所述待测非平胸鸟的熔解曲线含有两个特异峰，且溶解度峰值(DerivativeReporter(-Rn))在0.2-0.4之间无峰或有低值峰，所述待测非平胸鸟为或候选为雌性；如所述待测非平胸鸟的熔解曲线含有一个特异峰，且溶解度峰值在0.2-0.4之间无峰或有低值峰，所述待测非平胸鸟为或候选为雄性；
[0006]所述成套试剂由名称分别为P1、P2、P3和P4的四种单链DNA组成，所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的序列分别为序列表中序列1、2、3和4。
[0007]上述方法中，所述成套试剂中的所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的摩尔数均可相等。所述成套试剂中的所述P1、所述P2、所述P3和所述P4均可独立包装，也可包装在一起。
[0008]上述方法中，所述实时荧光定量PCR的反应体系中所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的浓度均可为1-10pmol/L，如5pmol/L。
[0009]上述方法中，所述实时荧光定量PCR的退火温度可为55-65℃，如55℃、60℃或65℃。
[0010]所述实时荧光定量PCR的反应条件可为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸60秒，3个循环；95℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸60秒，5个循环；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸60秒，32个循环。
[0011]上述方法中，所述待测非平胸鸟可为b1)或b2)：
[0012]b1)鹤科鸟；
[0013]b2)灰冠鹤、白枕鹤、黑颈鹤或丹顶鹤。
[0014]所述成套试剂，也属于本专利技术的保护范围。
[0015]所述成套试剂具有如下任一用途：
[0016]a1)鉴别或辅助鉴别非平胸鸟的性别；
[0017]a2)制备鉴别或辅助鉴别非平胸鸟的性别的试剂盒。
[0018]本专利技术还提供了鉴别或辅助鉴别非平胸鸟性别的试剂盒，所述试剂盒包括所述成套试剂。
[0019]所述试剂盒还可包括实时荧光定量PCR所用除引物外的其他试剂。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，所述其他试剂为2
×
qPCRmix与ROX(50*)，2
×
qPCRmix与ROX(50*)均为天根生化科技(北京)有限公司产品。
[0021]所述试剂盒可仅由所述成套试剂组成，还可由所述成套试剂与所述其他试剂组成。
[0022]所述产品可为试剂盒，也可为包括鉴别非平胸鸟性别时所用仪器的系统。
[0023]所述成套试剂，或所述试剂盒的下述任一应用，也属于本专利技术的保护范围：
[0024]c1)鉴别或辅助鉴别非平胸鸟的性别；
[0025]c2)制备鉴别或辅助鉴别非平胸鸟的性别的产品。
[0026]上文中，所述非平胸鸟可为b1)或b2)：
[0027]b1)鹤科鸟；
[0028]b2)灰冠鹤、白枕鹤、黑颈鹤或丹顶鹤。
[0029]本专利技术的鉴别非平胸鸟性别的方法使得四条引物在一管中通过一步扩增即可完成巢氏扩增和实时荧光定量PCR，操作简便，且反应在一个管中进行扩增，进而有效避免了假阳性结果，而且杜绝了有毒害的核酸染料的使用；另外，本专利技术的方法还具有高灵敏度、特异性、准确性的特征，鉴别雌性非平胸鸟的灵敏度可达10ng/反应体系，鉴别雄性非平胸鸟的灵敏度可达5ng/反应体系，能够利用微量样本，实现鸟类性别鉴定。本专利技术的鉴别非平胸鸟性别的方法以及所用成套试剂和试剂盒具有广泛的应用前景。
附图说明
[0030]图1为灰冠鹤雌性个体的熔解曲线。
[0031]图2为白枕鹤雌性个体的熔解曲线。
[0032]图3为灰冠鹤雌性个体的熔解曲线。
[0033]图4为黑颈鹤雌性个体的熔解曲线。
[0034]图5为丹顶鹤雌性个体的熔解曲线。
[0035]图6为灰冠鹤雄性个体的熔解曲线。
[0036]图7为白枕鹤雄性个体的熔解曲线。
[0037]图8为黑颈鹤雄性个体的熔解曲线。
[0038]图9为丹顶鹤的雌性个体基因组浓度为40ng/μl时的熔解曲线。
[0039]图10为丹顶鹤的雌性个体基因组浓度为20ng/μl时的熔解曲线。
[0040]图11为丹顶鹤的雌性个体基因组浓度为10ng/μl时的熔解曲线。
[0041]图12为丹顶鹤的雌性个体基因组浓度为5ng/μl时的熔解曲线。
[0042]图13为丹顶鹤的雌性个体基因组浓度为2ng/μl时的熔解曲线。
[0043]图14为丹顶鹤的雄性个体基因组浓度为40ng/μl时的熔解曲线。
[0044]图15为丹顶鹤的雄性个体基因组浓度为20ng/μl时的熔解曲线。
[0045]图16为丹顶鹤的雄性个体基因组浓度为10ng/μl时的熔解曲线。
[0046]图17为丹顶鹤的雄性个体基因组浓度为5ng/μl时的熔解曲线。
[0047]图18为丹顶鹤的雄性个体基因组浓度为2ng/μl时的熔解曲线。
具体实施方式
[0048]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5
′
末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3
′...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鉴别或辅助鉴别非平胸鸟性别的方法，包括：以待测非平胸鸟的基因组DNA为模板，利用成套试剂进行实时荧光定量PCR，根据实时荧光定量PCR的熔解曲线判定待测非平胸鸟的性别：如所述待测非平胸鸟的熔解曲线含有两个特异峰，且溶解度峰值在0.2-0.4之间无峰或有低值峰，所述待测非平胸鸟为或候选为雌性；如所述待测非平胸鸟的熔解曲线含有一个特异峰，且溶解度峰值在0.2-0.4之间无峰或有低值峰，所述待测非平胸鸟为或候选为雄性；所述成套试剂由名称分别为P1、P2、P3和P4的四种单链DNA组成，所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的序列分别为序列表中序列1、2、3和4。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应体系中所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的浓度均为1-10pmol/L。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的退火温度为55-65℃。4.根据权利要求1-4中任一所...

【专利技术属性】
技术研发人员：由玉岩，刘学锋，贾婷，卢岩，普天春，郑常明，杜洋，张成林，李晓光，
申请(专利权)人：北京动物园，
类型：发明
国别省市：