通用基因检测方法技术

本发明专利技术提供一种通用基因检测方法，所述方法包括以下步骤：配制PCR反应体系，执行PCR反应程序，PCR反应结束后在95℃变性1-3min，获得扩增产物，吸弃上清液，加入探针，降温到56-60℃，杂交3-5min后，处理杂交产物，检测杂交产物的荧光值，判定检测结果；其中，所述PCR反应体系包括固定引物、dNTP、PCR缓冲液、Extaq酶、DNA样本和去离子水；所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过标记。序列经过标记。

【技术实现步骤摘要】
通用基因检测方法


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种通用基因检测方法。

技术介绍

[0002]基因是遗传的基本单元，携带有遗传信息的DNA或RNA序列，通过复制，把遗传信息传递给下一代，指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表达。基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者外周静脉血或其他组织细胞，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子作检测，分析其所含有的基因类型和基因缺陷及其表达功能是否正常的方法，从而使人们能了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险。基因检测常用的技术包括qPCR技术和基因芯片技术。其中qPCR技术包括：SYBRGREEN染料法和Taqman探针法。基因芯片技术的一般策略是将探针(Capture Probe)固定在固相载体(芯片)表面。然后将待检测的核酸加入到芯片上，通过变性和退火使要检测的靶基因与探针进行特异性杂交，使探针特异性的捕获到靶基因。然后在体系中加入检测探针(Detection probe)，检测探针与靶基因进行杂交。一般检测探针是一端被标记了的寡核苷酸序列，标记的方式可以有很多种，可以用酶标记，可以用金标记然后硝酸银染色，也可以用荧光素标记。由于基因芯片技术本身的灵敏度比较低，在大多数情况下需要首先对样品中的靶基因进行扩增，扩增的手段可以选择PCR， NASBA，LAMP等核酸扩增技术。扩增完成之后再进行基因芯片的杂交检测。
[0003]qPCR技术的缺点在于，PCR的过程中会产生大量的靶基因扩增产物，这些产物没有被固定在固相载体上，很容易形成气溶胶。对整个检测的操作环境构成污染。所以进行临床样品的PCR检测必须在标准的PCR检测实验室中方可进行。标准的PCR检测实验室建设有强制性的要求，投资成本大，不适合基层医疗单位。并且这种方法的具体实施过程比较复杂，耗费时间，不利于设计成POCT的检测方式。
[0004]此外，qPCR技术和基因芯片技术的信号显示策略都是间接的，对于PCR技术及来说，信号显示的方式有两种，一种是SYBRGREEN染料，这是一种与DNA双链的小沟结合的荧光染料，PCR扩增过程中形成的双链会结合SYBRGREEN染料，染料与DNA双链结合后发出荧光用于检测。对于基因芯片检测技术来说，信号的采集一般是通过探针上标记的材料来实现的，就像上文提到的，对探针上标记的金颗粒进行银染，或者加入标记在探针上的酶的底物进行显色反应，或者检测连接在探针上的荧光素。所有这些检测手段在实际操作过程中都会导致检测步骤的繁琐，同时可能会导致灵敏度降低，或者出现假阳性以及假阴性的现象，不会准确的反应目的基因或扩增产物的真实情况。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种通用基因检测方法。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术第一方面，提供一种通用基因检测方法，所述方法包括以下步骤：配制PCR反应
体系，执行PCR反应程序，PCR反应结束后在95℃变性1-3min，获得扩增产物，吸弃上清液，加入探针，降温到56-60℃，杂交3-5min后，处理杂交产物，检测杂交产物的荧光值，判定检测结果；其中，所述PCR反应体系包括固定引物、dNTP、PCR缓冲液、taq酶、DNA样本和去离子水；所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过标记。
[0007]优选地，对所述探针一端或两端的核苷酸序列进行标记的方法选自酶标记、荧光素标记、或用金标记然后硝酸银染色。优选地，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过荧光素标记。
[0008]优选地，所述扩增产物包含引物序列和延伸序列，所述探针的序列跨越引物序列和延伸序列。
[0009]优选地，所述探针的序列的中间碱基是特异位点。
[0010]优选地，所述引物由通用核苷酸序列和特异性核苷酸序列结合而成，所述通用核苷酸序列不与所述DNA样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述DNA样品特异性结合。
[0011]所述引物中加入通用核苷酸序列，是为了使特异性核苷酸序列有充分的空间与DNA 样品结合。
[0012]优选地，所述通用核苷酸序列选自黄瓜的DNA片段。
[0013]优选地，所述引物的5
’
端添加有标签序列，以便对引物的5
’
端进行标记和检测。
[0014]优选地，所述引物的5
’
端经过氨基修饰，修饰后的引物通过氨基可以结合在固相载体上。
[0015]优选地，所述固相载体选自磁性颗粒、微球、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
[0016]本专利技术实施例利用磁性颗粒作为固相载体，利用磁力架与磁性颗粒之间的磁力，实现杂交产物的快速处理，操作简单，便于实现自动化。
[0017]优选地，所述荧光素选自异硫氰酸荧光素荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶或别藻青蛋白中的一种或多种。
[0018]本专利技术第二方面，提供一种基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包含固定引物、 PCR缓冲液、dNTP、Extaq酶、去离子水和探针，所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端的核苷酸序列经过标记。
[0019]优选地，对所述探针一端的核苷酸序列进行标记的方法选自酶标记、荧光素标记、或用金标记然后硝酸银染色。
[0020]优选地，所述引物由通用核苷酸序列和特异性核苷酸序列结合而成，所述通用核苷酸序列不与所述DNA样品特异性结合，所述特异性核苷酸序列与所述DNA样品特异性结合。
[0021]优选地，所述引物的5
’
端添加有标签序列，以便对引物的5
’
端进行标记。
[0022]优选地，所述引物的5
’
端经过氨基修饰，修饰后的引物通过氨基可以结合在固相载体上。
[0023]优选地，所述固相载体选自磁性颗粒、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
[0024]相对于现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术所述引物以单链的形式固定在固相载体上，漂洗后加入荧光标记的探针与固相载体上的单链进行杂交，洗涤多余探针之后直接进行荧光值的判读，大大简化检测步骤，同时能提高灵敏度，避免出现假阳性以及假阴性的现象，能够准确的反应靶基因或扩增产物的真实情况。
[0025]本专利技术所述通用基因检测方法适用于所有基于引物单链扩增和探针检测的基因特性检测和分析，能显著提升检测环境，大幅度减少检测时间，在医疗机构、科研院所等场合具有较大的应用价值。
具体实施例
[0026]下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本专利技术，不应视为对本专利技术的具体限制。
[0027]试剂耗材：PCR缓冲液，采购自康为世纪生物科技有限公司，产品编号为：CW0680M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.通用基因检测方法，该方法适用于基于引物单链扩增的基因特性检测，其特征在于，所述方法包括以下步骤：配制PCR反应体系，执行PCR反应程序，PCR反应结束后在95℃变性1-3min，吸弃上清液，加入探针，降温到56-60℃，杂交2-5min后，处理杂交产物，检测杂交产物的荧光值，判定检测结果；其中，所述PCR反应体系包括固定引物、dNTP、PCR缓冲液、Extaq酶、DNA样本和去离子水；所述固定引物由固相载体与所述引物结合而成，所述探针一端或两端的核苷酸序列经过标记。2.根据权利要求1所述的通用基因检测方法，其特征在于，对所述探针一端或两端的核苷酸序列进行标记的方法选自酶标记、荧光素标记、或用金标记然后硝酸银染色。3.根据权利要求1所述的通用基因检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏宏泉，孙相鑫，
申请(专利权)人：拓原合壹宁波生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：