双色荧光双重检测的微流控芯片及方法技术

本发明专利技术属于核酸检测技术领域，具体涉及用于核酸检测的微流控芯片及方法。双色荧光双重检测的微流控芯片，包括盖片和基片，所述的盖片为双层结构，包括阀门控制层和微流道层；所述阀门控制层用于控制所述微流道层流道内液体走向；所述微流道层包括多个检测单元，每个检测单元包括两条微流道；所述微流道的一端设有进样孔，另一端设有微腔和出样孔；所述基片中，与微流道对应的位置修饰有纳米级氧化石墨烯或石墨烯材料，与微腔对应的位置修饰有戊二醛。本发明专利技术的芯片，配合不同的荧光标记技术，在微流道区域测量荧光信号变化，以及在微腔区测量荧光信号变化，达到双重检测，互相印证的效果，从而达到miRNAs的快速、灵敏，准确的双色双重检测。重检测。重检测。

【技术实现步骤摘要】
双色荧光双重检测的微流控芯片及方法


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及用于核酸检测的微流控芯片及方法。

技术介绍

[0002]癌症是全球死亡的主要原因之一，并给患者带来极大的痛苦。传统的检测手段多是采用计算机断层扫描（CT），核磁共振、放射性检测、病理检测和血液检查等，这些方法大多使用的仪器庞大，操作繁琐，费时费力，灵敏度低，特异性差。此外，在大多数情况下，传统的检测技术仅可以检测到较大的肿瘤，往往在确诊时，患者已经是癌症的中期或晚期，无法进行早期诊断，贻误治疗时机。
[0003]为了实现肿瘤的早诊断、早治疗，更多的研究人员专注于检测肿瘤标志物，肿瘤标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。肿瘤标志物检测具有的优势在于：敏感性高，能早期检测出肿瘤患者；特异性好，能准确鉴别肿瘤/非肿瘤患者；有器官特异性，方便对肿瘤的定位；血清中水平与肿瘤体积大小、临床分期相关，用以判断预后；半衰期短，可反映肿瘤的动态变化，监测治疗效果、复发和转移测定方法精密度、准确性高，操作方便。
[0004]miRNA是一类本身不具备编码蛋白质功能的内生性RNA，约有18-25个核苷酸长度的内源性单链小分子RNA。研究表明某些miRNA的异常表达与肿瘤发生、肿瘤分期和肿瘤治疗密切相关，可明确检测血清中miRNA的存在。所有这些发现表明，miRNA可用作肿瘤标志物，对恶性疾病的早期诊断具有积极的临床意义。
[0005]目前，广泛应用的miRNA分析方法，包括实时逆转录聚合酶链反应（PCR），RNA印迹技术（Northern blotting）和miRNA微阵列技术等在一定程度上可以满足检测要求。然而，这些方法需要转录和扩增，这既费时又费力，一些方法需要昂贵的试剂盒和复杂的处理，并且检测通量较低。因此，需要建立灵敏，快速，低成本且易于操作的miRNA检测系统。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种对miRNA进行检测的微流控芯片及方法，能够同时对同一份检测样品进行不同肿瘤标志物的双色荧光双重检测，极大提高了检测的灵敏度和精度，实现肿瘤标志物快速、高通量检测，为肿瘤早期诊断提供有效的检测手段。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用第一种技术方案是：双色荧光双重检测的微流控芯片，包括盖片和基片，所述的盖片为双层结构，包括阀门控制层和微流道层；所述阀门控制层用于控制所述微流道层液体流道的开启和闭合；所述微流道层包括多个检测单元，每个检测单元包括两条微流道；所述微流道的一端设有进样孔，另一端设有微腔和出样孔；所述的基片上，与所述微流道对应的位置修饰有纳米级氧化石墨烯或石墨烯材料，与所述微腔对应的位置修饰有戊二醛。
[0008]作为本专利技术的一种优选方式，所述的进样孔包括探针进样孔和样品进样孔，所述两条微流道分别与两个不同的探针进样孔连接，与同一个样品进样孔连接。
[0009]作为本专利技术的一种优选方式，两条微流道分别与两个不同的微腔连接，所述两个微腔之间不连通。
[0010]作为本专利技术的一种优选方式，两条微流道与同一个微腔连接。
[0011]作为本专利技术的一种优选方式，所述的阀门控制层包括若干控制液体进入和流出所述微流道的阀门、进/出水口，以及连接所述进/出水口与阀门之间的流道。作为本专利技术的一种优选方式，所述基片上修饰的纳米级氧化石墨烯或石墨烯材料上，铺设带有荧光基团或者经荧光染色的探针。
[0012]本专利技术还提供一种双色荧光双重检测方法，包括：关闭微流道与微腔之间的阀门；通过两个不同的探针进样孔，分别向两条微流道内注入不同的DNA探针，使其充满流道，孵育0.5-2h；通过出样口排出多余的液体，并用PBS冲洗微流道，去除没有吸附在基片上的单链DNA；对流道中的DNA探针的荧光信号进行检测；打开微流道与微腔之间的阀门，关闭出样口及DNA进样孔处的阀门，然后从样品进样孔注入待测样本，使用氮气同时将其推入到两条流道中；待测样品与微流道内的DNA探针反应后经微流道流入微腔内；对流道内和进入微腔内的液体进行荧光检测；根据不同的荧光颜色和荧光强度，判断待测样本中是否含目标miRNA。
[0013]进一步优选地，将流道内液体荧光的检测结果与DNA探针的荧光信号进行对比，或者根据微腔中荧光强度，判断待测样本中目标miRNA的含量。
[0014]作为本专利技术的一种优选方式，所述的DNA探针的3
’
端修饰有NH2C6基团。
[0015]进一步优选地，所述NDA探针采用荧光染料进行染色，或者在DNA探针的5
’
端修饰荧光基团。
[0016]本专利技术与现有技术相比，具有的有益效果是：本专利技术结合纳米氧化石墨烯和戊二醛的发展，将它们通过自主装技术组装到载玻片上，与高通量的双层微流控芯片技术相集成，能同时检测不同的肿瘤标志物。该芯片可以通过控制阀门来控制流量，可控性强，配合不同的荧光标记技术，从而达到miRNAs的快速、灵敏，准确的双色双重检测。
附图说明
[0017]图1为本专利技术提供的一种用于miRNA双色双重荧光检测的微流控芯片实验原理图；图2为本专利技术提供的红绿双色双重荧光检测微流控芯片的立体透视图；图3为本专利技术提供的红绿双色双重荧光检测微流控芯片的结构正视图；图4为本专利技术提供的红绿双色双重荧光检测微流控芯片的微流道层结构示意图图5为本专利技术提供的红绿双色双重荧光检测微流控芯片的阀门控制层结构示意图；图6为本专利技术提供的蓝绿双色双重荧光检测微流控芯片的立体透视图；图7为本专利技术提供的蓝绿双色双重荧光检测微流控芯片的结构正视图；图8为本专利技术提供的蓝绿双色双重荧光检测微流控芯片的微流道层结构示意图；
图9为本专利技术提供的蓝绿双色双重荧光检测微流控芯片的阀门控制层结构示意图。
具体实施方式
[0018]为了便于理解本专利技术，下面结合附图和具体实施例，对本专利技术进行更详细的说明。附图中给出了本专利技术的较佳的实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0019]本专利技术提供的第一个实施例是：红绿双色荧光双重检测的微流控芯片，其结构如图2所示，该微流控芯片自下而上依次由：修饰了石墨烯和戊二醛的载玻片基底1、微流道层2和阀门控制层3组成。其中微流道层2和阀门控制层3采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）和与之配对的固化剂，按照10：1比例混合制备而成，该材料具有良好的生物相容性和化学惰性。 微流道层2主要作用是用来固定DNA探针和样品检测，如图3和4所示，微流道层2包括多个检测单元，在一张芯片上可以实现高通量检测。其中每一个检测单元包括第一流道11、第二流道16。第一流道11和第二流道16的结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双色荧光双重检测的微流控芯片，包括盖片和基片，其特征在于：所述的盖片为双层结构，包括阀门控制层和微流道层；所述阀门控制层用于控制所述微流道层流道内液体走向；所述微流道层包括多个检测单元，每个检测单元包括两条微流道；所述微流道的一端设有进样孔，另一端设有微腔和出样孔；所述的基片上，与所述微流道对应的位置修饰有纳米级氧化石墨烯或石墨烯材料，与所述微腔对应的位置修饰有戊二醛。2.根据权利要求1所述的双色荧光双重检测的微流控芯片，其特征在于：所述的进样孔包括探针进样孔和样品进样孔，所述两条微流道分别与两个不同的探针进样孔连接，与同一个样品进样孔连接。3.根据权利要求2所述的双色荧光双重检测的微流控芯片，其特征在于：两条微流道分别与两个不同的微腔连接，所述两个微腔之间不连通。4.根据权利要求2所述的双色荧光双重检测的微流控芯片，其特征在于：两条微流道与同一个微腔连接。5.根据权利要求1-4任一项所述的双色荧光双重检测的微流控芯片，其特征在于：所述的阀门控制层包括若干控制液体进入和流出所述微流道的阀门、进/出水口，以及连接所述进/出水口与阀门之间的流道。6.根据权利要求1-4任一项所述的双色荧光双重检测的微流控芯片，其特征在于：所述基片上修饰的纳米级氧化石墨烯或石墨烯材料上，铺设带有荧光基团...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩琳，高亚坤，张宇，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：