一种双层微流控芯片、检测新型冠状病毒的试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，涉及一种用于病毒核酸检测的双层微流控芯片及试剂盒和方法。双层微流控芯片，该芯片包括加样层和检测层，所述加样层上设有至少两个加样口；所述检测层上设有检测腔、出样口；所述检测腔与所述加样口通过进样微流道连接；所述出样口与所述检测腔通过出样微流道连接。本发明专利技术提供的试剂盒，包含所述的双层微流控芯片、含有RdRP基因及E基因荧光探针的检测溶液、纳米材料溶液、冠状病毒标准溶液和阳离子溶液。本发明专利技术采用了封闭的双层微流控芯片检测体系，不同的物品或试剂从不同的加样口加入，能减少外界核酸带来的污染干扰。试剂盒采用纳米技术与微流控技术相结合，能够在1小时内获得检测结果，特异性强，灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种双层微流控芯片、检测新型冠状病毒的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于病毒检测
，涉及一种用于病毒核酸检测的双层微流控芯片及试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS) 和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。新型冠状病毒的确诊需通过核酸检测，呈阳性才能确诊。目前使用实时荧光定量PCR方法检测核酸呈现较高的假阴性率，会使很多已经感染的患者误以为还没有感染，进而造成更大范围的人传人感染。因此，为了更好的控制新型冠状病毒疫情，急需使用新的检测方法降低核酸检测的假阴性率。标记技术，从而达到2019新型冠状病毒核酸的快速、灵敏、准确检测。
[0003]RdRP基因、E基因是2019新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性最高的两种基因，也是目前2019新型冠状病毒(2019-nCoV)常规检测试剂盒中最常被检测的两种基因。自2020年初通过对2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的全基因组序列测序得出。2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的RdRp基因含有98个RNA碱基，位于全序列的中端；E基因含有112个RNA碱基，位于全序列的末端。
[0004]现有的新型冠状病毒检测试剂盒在检测中存在准确率低，假阳性和假阴性率高等问题，并且检测过程耗时，不能满足快速检测的需要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种能够快速、简便、准确的检测血浆中新型冠状病毒 (2019-nCoV)RdRP基因和E基因的微流控芯片、试剂盒，以及检测新型冠状病毒(2019-nCoV)含量的方法。
[0006]本专利技术解决其技术问题首先提供了一种双层微流控芯片，该芯片包括加样层和检测层，所述加样层上设有至少两个加样口；所述检测层上设有检测腔、出样口；所述检测腔与所述加样口通过进样微流道连接；所述出样口与所述检测腔通过出样微流道连接。
[0007]作为本专利技术的一种优选方式，每个加样口与检测腔之间连接一条进样微流道。
[0008]进一步优选地，所述双层微流控芯片设置10-50个检测单元。
[0009]为了解决本专利技术的技术问题，本专利技术还提供一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括所述的双层微流控芯片、含有RdRP基因荧光探针及E基因荧光探针的检测溶液、冠状病毒标准溶液、纳米材料溶液和阳离子溶液。
[0010]进一步优选地，所述含有RdRP基因荧光探针及E基因荧光探针的检测溶液由缓冲液、0.5～21μM的3
’
端荧光分子标记的RdRP基因荧光探针及E基因荧光探针混合而成。
[0011]进一步优选地，所述的纳米材料选自纳米金颗粒、纳米石墨烯或纳米氧化石墨烯材料、纳米硫化钨、纳米硒化钨中的任一种，其溶液浓度为2～50ug/mL。
[0012]进一步优选地，所述阳离子溶液中，各组分的浓度为：2.5mM氯化镁,0.5mM 氯化钙，0.5mM氯化钠，0.05mM硝酸钠，0.05mM磷酸氢钠，0.01mM氯化铁，0.01mM硫酸铜，0.01mM硫酸锌，0.01mM氯化钴，0.01mM氯化锰。
[0013]进一步优选地，所述冲洗液为浓度0.05％的柠檬酸钠溶液。
[0014]本专利技术进一步提供了一种检测新型冠状病毒的方法，包括：
[0015](1)从其中一个加样口注入含有RdRP基因荧光探针及E基因荧光探针的检测溶液、纳米材料溶液、阳离子溶液到检测腔中，此时DNA探针被纳米材料吸附，荧光淬灭；
[0016](2)将冠状病毒待测溶液从另一个加样口注入，使其进入到检测腔中；
[0017](3)将芯片置于室温～60℃孵育5～40分钟后，对检测腔中的荧光信号进行检测，并记录荧光值；
[0018](4)根据病毒标准溶液梯度浓度及荧光强度，计算标准线性回归方程；
[0019](5)将测定的待测溶液的荧光强度，代入所述的标准线性回归方程，计算出待测溶液中新型冠状病毒基因的浓度。
[0020]本专利技术提供的另一种检测新型冠状病毒的方法，包括：
[0021](1)从不同的加样口分别注入含有RdRP基因荧光探针及E基因荧光探针的检测溶液和冠状病毒待检测溶液，两种溶液进入到检测腔中，在室温～60℃孵育 5～40分钟；
[0022](2)将纳米材料溶液从加样口注入，使其进入到检测腔中；
[0023](3)对检测腔中的荧光信号进行检测，并记录荧光值；
[0024](4)根据病毒标准溶液梯度浓度及荧光强度，计算标准线性回归方程；
[0025](5)将测定的待测溶液的荧光强度，代入所述的标准线性回归方程，计算出待测溶液中新型冠状病毒基因的浓度。
[0026]本专利技术的有益效果是：本专利技术采用了封闭的双层微流控芯片检测体系，不同的物品或试剂从不同的加样口加入，减少交叉污染，能减少外界核酸带来的污染干扰。本专利技术的试剂盒采用纳米技术与微流控技术相结合，对新型冠状病毒 (2019-nCoV)进行检测，能够在1小时内获得检测结果，特异性强，灵敏度高。本专利技术将含有RdRP基因及E基因荧光探针的检测溶液、待测样本、阳离子溶液、冲洗液在一个检测单元中进行检测，过程一步完成，反应过程完全封闭，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。
[0027]本专利技术所使用的探针为3
’
端CY3标记的荧光探针，即单链时荧光基团发出的荧光被纳米材料吸收；但待测物出现与探针发生杂交反应后报告基团就可释放出荧光，被荧光计检测到。因此本专利技术不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例的核酸检测双层微流控芯片的结构示意图；
[0029]图2为图一的分解图；
[0030]图3为本专利技术实施例的核酸检测双层微流控芯片的结构正视图；
[0031]图4为加样层结构示意图；
[0032]图5为检测层结构示意图；
[0033]图6为RdRp基因样本浓度与荧光强度的线性回归方程；
[0034]图7为E基因样本浓度与荧光强度的线性回归方程；
[0035]图8为不同浓度冠状病毒标准溶液实际检测水平与理论预测水平对比。
具体实施方式
[0036]为了便于理解本专利技术，下面结合附图和具体实施例，对本专利技术进行更详细的说明。附图中给出了本专利技术的较佳的实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0037]本专利技术的提供的第一个实施例是：一种双层微流控芯片，如图1-3所示，该芯片由加样层1和检测层2组成。加样层1主要作用是用来加入DNA探针、待测样品和其他试剂；检测层2主要是用来提供反应容器、及反应后检测反应物的荧光信号。
[0038]如图1所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双层微流控芯片，其特征在于：该芯片包括加样层和检测层，所述加样层上设有至少两个加样口；所述检测层上设有检测腔、出样口；所述检测腔与所述加样口通过进样微流道连接；所述出样口与所述检测腔通过出样微流道连接。2.根据权利要求1所述的双层微流控芯片，其特征在于：每个加样口与检测腔之间连接一条进样微流道。3.根据权利要求1所述的双层微流控芯片，其特征在于：每个芯片设置10-50个检测单元。4.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3任一项所述的双层微流控芯片、含有RdRP基因荧光探针及E基因荧光探针的检测溶液、冠状病毒标准溶液、纳米材料溶液和阳离子溶液。5.根据权利要求4所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述含有RdRP基因荧光探针及E基因荧光探针的检测溶液由缓冲液、0.5～21μM的3
’
端荧光分子标记的RdRP基因荧光探针及E基因荧光探针混合而成。6.根据权利要求4所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述的纳米材料选自纳米金颗粒、纳米石墨烯或纳米氧化石墨烯材料、纳米硫化钨、纳米硒化钨中的任一种，其浓度为2～50ug/mL。7.根据权利要求4所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述阳离子溶液中，各组分的浓度为：2.5 mM氯化镁,0.5 mM氯化钙，0.5 mM 氯化钠，0.05 mM 硝酸钠，0.05 mM 磷酸氢钠，0.01 mM 氯化铁，0....

【专利技术属性】
技术研发人员：韩琳，强乐，张宇，刘宏，王敏，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：