象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用制造技术

本发明专利技术公开了象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用。本发明专利技术提供了一种蛋白质，命名为MSP19蛋白，是序列表的序列5或序列1所示的蛋白质。编码MSP19蛋白的基因也属于本发明专利技术的保护范围，命名为MSP19基因。本发明专利技术还保护MSP19基因在培育对根结线虫的抗性降低的转基因植物中的应用。本发明专利技术还保护用于抑制MSP19基因表达的物质在培育对根结线虫的抗性增高的转基因植物中的应用。本发明专利技术为象耳豆根结线虫致病机理研究提供基因资源和防治的理论依据。

【技术实现步骤摘要】
象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用。
技术介绍
根结线虫(Meloidogynespp.)是一类活体营养固着型内寄生植物病原线虫。根结线虫寄主范围广，适应性强，对农业生产危害严重，造成巨大经济损失。象耳豆根结线虫(Meloidogyneenterolobii)于1983年在我国海南省首次发现，之前只在我国南方有分布，并未受到重视。但后续研究发现其寄主范围非常广泛，并且可以克服根结线虫抗性基因Mi-1基因和N基因，同时不会被根结线虫的生防菌穿刺巴氏杆菌(Pasteuriapenetrans)寄生，表现出较强的致病力。由此可见，象耳豆根结线虫对我国农业生产威胁巨大，一旦发生大面积扩散或定殖，将会造成毁灭性的的灾害。近年来随着产业结构调整，我国北方设施栽培面积逐步扩大，以及全球气候变暖等因素的影响使土壤温度的上升，将会使象耳豆根结线虫入侵内陆地区成为可能。据报道，象耳豆根结线虫已在我国广东、福建、广西、云南以及湖南等省份发现，一旦入侵内陆这将会给全国的农作物生产带来威胁。由于对象耳豆根结线虫致病机理研究不足，传统的防治方法存在特异性差、副作用大、防效有限等突出问题。近年来随着分子生物学技术的发展，应用分子手段筛选与植物病原线虫寄生致病相关的基因，并深入研究其致病机理已成为植物病原线虫研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用。本专利技术提供了一种蛋白质，获自象耳豆根结线虫(Meloidogyneenterolobii)，命名为MSP19蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)序列表的序列5所示的蛋白质；(a2)序列表的序列1所示的蛋白质；(a3)来源于象耳豆根结线虫且与(a1)或(a2)具有98％以上同一性且与象耳豆根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的蛋白质；(a4)将(a1)或(a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与象耳豆根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的由(a1)或(a2)衍生的蛋白质。编码MSP19蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围，命名为MSP19基因。MSP19基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)编码区如序列表的序列6所示的DNA分子；(b2)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；(b3)来源于象耳豆根结线虫且与(b1)或(b2)具有98％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。含有MSP19基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护MSP19蛋白的应用，为如下(c1)至(c3)中的至少一种：(c1)调控根结线虫的寄生能力；(c2)调控根结线虫的致病能力；(c3)抑制植物免疫反应。本专利技术还保护抑制MSP19基因表达的干扰载体。以载体pSAT5为骨架载体，在NcoⅠ和XhoⅠ位点之间插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，在PstⅠ和KpnⅠ位点之间插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到重组质粒pSAT5-RNAiMSP19。将重组质粒pSAT5-RNAiMSP19用XbaI和KpnI双酶切，回收具有干扰片段的酶切产物(干扰片段即序列3所示的区段和序列4所示的区段)；将载体pSUPER用XbaI和KpnI双酶切，回收载体骨架；将所述酶切产物与所述载体骨架连接，得到具有所述干扰片段的重组质粒，即为干扰载体。本专利技术还保护MSP19基因在培育对根结线虫的抗性降低的转基因植物中的应用。本专利技术还保护用于抑制MSP19基因表达的物质在培育对根结线虫的抗性增高的转基因植物中的应用。用于抑制MSP19基因表达的物质具体可为所述干扰载体。本专利技术还保护一种培育对根结线虫的抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：将MSP19基因导入目的植物，得到对根结线虫的抗性降低的植物。将MSP19基因导入目的植物具体可为将具有MSP19基因的重组表达载体导入目的植物。具有MSP19基因的重组表达载体具体可为：在载体pSuper1300的XbaI和KpnI位点之间插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到的重组质粒Super1300-NSMSP19。本专利技术还保护一种培育抗根结线虫的植物的方法，包括如下步骤：将抑制MSP19基因表达的物质导入目的植物，得到对根结线虫的抗性增高的植物。抑制MSP19基因表达的物质具体可为所述干扰载体。以上任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。以上任一所述植物可为十字花科植物。以上任一所述植物可为拟南芥属植物。以上任一所述植物可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。以上任一所述植物可为茄科植物。以上任一所述植物可为烟草。以上任一所述根结线虫具体可为象耳豆根结线虫。通过原位杂交技术，发现MSP19基因在线虫食道腺部位特异表达，表明MSP19为食道腺体特异表达的蛋白，并且会分泌到细胞外发挥作用。亚细胞定位实验模拟MSP19在植物细胞发挥作用的部位，实验发现烟草的整个细胞都有表达，表明其可能分泌到植物细胞后在整个细胞发挥作用。实时荧光定量PCR检测了MSP19虫态发育表达模式，发现此基因在线虫寄生植物后的虫态时期，基因表达量会维持在较高水平，表明MSP19可能参与了线虫寄生以及巨大细胞维持。MSP19超表达拟南芥株系对线虫的敏感性显著升高，相反拟南芥介导的RNAi干扰株系对线虫的敏感性显著降低，表明MSP19是线虫致病过程中的一个关键基因。同时对MSP19基因功能初步探究发现，在烟草叶片上瞬时表达该蛋白其可以抑制由BAX引起的免疫坏死反应，且可以抑制由线虫侵染植物根部引起的活性氧的爆发，表明该基因具有抑制植物的免疫反应的功能。本专利技术为象耳豆根结线虫致病机理研究提供基因资源和防治的理论依据。附图说明图1为原位杂交实验的结果。图2为亚细胞定位的结果。图3为MSP19基因的相对表达丰度的结果。图4为三个干扰株系中，平均每株植株上的根结数目和线虫数目。图5为三个超表达株系中，平均每株植株上的根结数目和线虫数目。图6为ROS实验的结果。图7为细胞程序性坏死的结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：/n(a1)序列表的序列5所示的蛋白质；/n(a2)序列表的序列1所示的蛋白质；/n(a3)来源于象耳豆根结线虫且与(a1)或(a2)具有98％以上同一性且与象耳豆根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的蛋白质；/n(a4)将(a1)或(a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与象耳豆根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的由(a1)或(a2)衍生的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)序列表的序列5所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a3)来源于象耳豆根结线虫且与(a1)或(a2)具有98％以上同一性且与象耳豆根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的蛋白质；
(a4)将(a1)或(a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与象耳豆根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的由(a1)或(a2)衍生的蛋白质。


2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区如序列表的序列6所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b3)来源于象耳豆根结线虫且与(b1)或(b2)具有98％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)杂交且编码所...

【专利技术属性】
技术研发人员：简恒，孙许谦，闫世艳，刘倩，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11