一种UPLC-MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法技术

本发明专利技术属于污水生物检测领域，涉及一种UPLC‑MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法。该方法包括：(1)样品前处理：收集样品双蒸水洗涤后，加入乙二胺四乙酸四钠，然后进行超声处理；(2)UPLC‑MS/MS检测：将步骤(1)处理后的样品加入UPLC‑MS/MS中，梯度洗脱；所用的色谱柱为C18柱；色谱条件包括：进样量10～20μL；流速0.1～0.3mL/min；分析时间8～12min；最大柱压580～620bar；柱温32～38℃；(3)微生物聚集体群感效应分子的检测：根据步骤(2)UPLC‑MS/MS的检测结果，对样品中群感效应分子进行定性和/或定量判断。本方法具有准确性和灵敏度高的特点，且操作简便，是一种群感效应分子的微量检测方法。

【技术实现步骤摘要】
一种UPLC-MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法
本专利技术属于污水生物检测领域，具体地，涉及一种UPLC-MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法。
技术介绍
污水生物处理是目前运行成本较低的污水处理方式，也是应用最为广泛的污水处理技术。不管是活性污泥还是生物膜技术，其微生物都是以聚集态存在。这种聚集体的存在一方面有利于泥水混合液在沉淀设施中完成固液分离，另一方面也提供了一个较为完善的生态系统：不同类型菌群可协同作用，实现不同类型污染物的去除，同时也可有效地抵抗外界环境的变化(如抗冲击负荷)。污水生物处理系统中微生物聚集体形态包括悬浮态、附着态，其中颗粒污泥和生物膜是一种特殊的微生物聚集体形态，因其具有良好的沉降性能、高生物截留率和抗冲击负荷能力，其功能决定了废水生物处理单元的效果，在污水生物处理过程中至关重要，其聚集特征对于其工艺的运行效率具有重要的意义。微生物的聚集特性包含两层含义：一是聚集体在物理空间上的致密程度，二是不同的微生物种群的聚集。前者对污泥最明显的影响就是其沉淀性能，而后者主要影响微生物的生物降解过程。而目前从微生物群落结构或微生态学对这两者尚缺少系统的研究。研究表明，微生物分泌胞外聚合物的行为对于水处理系统的研究来说极为重要，这种分泌行为会受到群体感应“通讯”改变的影响，降低微生物聚集体稳定性，导致污泥膨胀，进而影响污水系统中生物处理的效果和出水水质的稳定性。污泥颗粒化和污泥膨胀代表了微生物聚集体聚集度的两个方向(或状态)，筛选污泥膨胀和促进污泥颗粒化的相关因素是微生物聚集体稳定性研究的重要内容。因此，群体感应系统对微生物聚集体的形成、稳定性以及功能影响是污水生物处理系统需要进一步深入的研究领域。群体感应现象在细菌中首先被发现，许多细菌在生长过程中能合成并释放一种被称为自诱导物质(AI)的信号分子，进行细胞间的信息交流和通讯，调控菌体中相关基因进行转录和细菌的生物行为，以适应环境的变化，这种信息交流现象称为群体感应(QS)。当细菌外部环境累积的群体感应信号达到临界浓度，即与细菌的群体感应信号受体蛋白作有效识别反应，进而同步协调整个细菌群体的基因表达和各种生物活动。不同细菌可能产生不同的群体感应信号，可调控种群内和种群间微生物的生长和代谢，目前已知的群体感应信号包括酰基高丝氨酸内酯(AHLs)、呋喃硼酸二酯(AI-2)、寡肽类分子、羟基棕榈酸甲基酯(PAME)和扩散性信号分子(DSF)等。污水处理系统中不同的微生物之间同样存在群体感应，根据菌群密度和周围环境变化调节基因表达以调控污水系统中细菌的诸多生理功能，如菌群结构、胞外多聚物(EPS)合成和分泌、细菌聚集以及生物膜形成等。上述信号分子在污水生物处理系统微生态中起到重要作用。菌群感应调控系统菌群结构，菌群密度依赖性很有可能与群体感应系统有关。有研究发现，在启动厌氧氨氧化反应过程中，添加了少量活性较好的厌氧氨氧化颗粒污泥，反应器厌氧氨氧化菌活性有了显著提高。此外，细菌生物膜形成是细菌密度依赖性的一种重要形式，也与群体感应有着十分密切的关系；AOB在生长过程中往往以微生物团聚体的形式(如颗粒污泥、生物膜等)存在，且会出现“抱团”与“解散”的现象，推测AOB的团聚与解散行为也可能与群体感应调控有关。确定AOB群体感应系统存在，给出AOB具有群体感应系统的直接证据(如检测AI)，有助于控制AOB污泥颗粒化，提高AOB污泥的活性和沉降性，所以，研究污水处理系统中菌群群体感应与AOB菌群结构和活性具有深远的科学意义和很高的工程价值。总之，污水生物处理系统关键环节中不同污泥状态，颗粒污泥和生物膜形成以及其稳定性与群体感应密切相关，群感效应分子的检测成为微生物聚集体研究的前提。群感效应对于微生物聚集体的形成、稳定和功能具有重要的作用，但目前关于微生物聚集体中群体感应的研究较少，主要还停留在系统混合相中AHLs信号分子的检测和研究上，对于颗粒污泥和生物膜中群感效应信号分子分布和种类，进而揭示微生物聚集体的功能机制的研究鲜有报道。目前，关于信号分子AHL的检测方法通常有3种：①理化手段，主要通过高效液相色谱(HPLC)、气质联用(GC-MS)技术检测纯化来自液体培养基的标本，该方法除能定量外，还能鉴定AHL的性质；②利用传感菌的生物学方法，即群体感应系统控制的色素或荧光如绿色荧光蛋白的产生来检测AHL的存在；③结合物理、化学手段和生物发光的薄层层析。这些方法主要集中对水相的研究上，即主要检测上清液中信号分子的种类和浓度。目前，对细菌信号分子的分析方法包括薄层层析与细菌生物感应器相结合(TLC-Biosensor)的方法，GC-MS法及HPLC-MS法。其中TLC-Biosensor法目前广泛采用，但不同的细菌生物感应器对不同酰基侧链长度的AHLs敏感性不同，如根癌农杆菌对酰基侧链C-3羰基取代的AHLs敏感性最强，而紫色杆菌对短链的C-3没有取代基的AHLs比较敏感。因此，不能准确地定性AHLs的种类。此方法也无法进行准确的定量分析。GC-MS及HPLC-MS法能够对细菌所释放AHLs进行定性分析，但其在混合进样及微量定量分析上无法满足实验的需求。利用HPLC-MS/MS对AHLs类信号分子进行了分析，但其检测方法分析时间较长(约40min)，灵敏度低，无法满足超低量AHL类信号分子的检测。超高效液相色谱(UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC)具有比HPLC更高的灵敏度，目前，有关UPLC-MS/MS对AHLs类信号分子进行定性及定量分析的研究鲜有报道。因此，微生物聚集体作为系统中重要的功能单元，明确信号分子在微生物聚集体(颗粒污泥和生物膜)中的分布规律是研究其群体感应的前提，建立基于微生物聚集体中群感效应分子的测定方法，对于深入了解微生物聚集体的形成、稳定和功能机制，以及改善废水生物处理系统运行性能具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种可在低浓度领域对微生物聚集体(颗粒污泥和生物膜)快速同时定性、定量检测群感效应分子的分析方法。为了实现上述目的，本专利技术提供一种UPLC-MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法，该方法包括：(1)样品前处理收集样品双蒸水洗涤后，加入乙二胺四乙酸四钠，然后进行超声处理；(2)UPLC-MS/MS检测将步骤(1)处理后的样品加入UPLC-MS/MS中，梯度洗脱；所用的色谱柱为C18柱；色谱条件包括：进样量10～20μL；流速0.1～0.3mL/min；分析时间8～12min；最大柱压580～620bar；柱温32～38℃；洗脱条件包括：用A相液体和B相液体进行洗脱，所述的A相液体为含有4～6mmoI/L乙酸铵和0.08～0.12％(V/V)甲酸的乙腈溶液；所述的B相液体为含有4～6mmoI/L乙酸铵和0.08～0.12％(V/V)甲酸的水溶液；(3)微生物聚集体群感效应分子的检测根据步骤(2)UPLC-MS/MS的检测结果，对样品中群感效应分子3-O-C6-HSL、3-O-C8-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种UPLC-MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法，其特征在于，该方法包括：/n(1)样品前处理/n收集样品双蒸水洗涤后，加入乙二胺四乙酸四钠，然后进行超声处理；/n(2)UPLC-MS/MS检测/n将步骤(1)处理后的样品加入UPLC-MS/MS中，梯度洗脱；所用的色谱柱为C18柱；/n色谱条件包括：进样量10～20μL；流速0.1～0.3mL/min；分析时间8～12min；最大柱压580～620bar；柱温32～38℃；/n洗脱条件包括：用A相液体和B相液体进行洗脱，所述的A相液体为含有4～6mmoI/L乙酸铵和0.08～0.12％(V/V)甲酸的乙腈溶液；所述的B相液体为含有4～6mmoI/L乙酸铵和0.08～0.12％(V/V)甲酸的水溶液；/n(3)微生物聚集体群感效应分子的检测/n根据步骤(2)UPLC-MS/MS的检测结果，对样品中群感效应分子3-O-C6-HSL、3-O-C8-HSL、3-O-C10-HSL、3-O-C12-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL进行定性和/或定量判断。/n

【技术特征摘要】
1.一种UPLC-MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)样品前处理
收集样品双蒸水洗涤后，加入乙二胺四乙酸四钠，然后进行超声处理；
(2)UPLC-MS/MS检测
将步骤(1)处理后的样品加入UPLC-MS/MS中，梯度洗脱；所用的色谱柱为C18柱；
色谱条件包括：进样量10～20μL；流速0.1～0.3mL/min；分析时间8～12min；最大柱压580～620bar；柱温32～38℃；
洗脱条件包括：用A相液体和B相液体进行洗脱，所述的A相液体为含有4～6mmoI/L乙酸铵和0.08～0.12％(V/V)甲酸的乙腈溶液；所述的B相液体为含有4～6mmoI/L乙酸铵和0.08～0.12％(V/V)甲酸的水溶液；
(3)微生物聚集体群感效应分子的检测
根据步骤(2)UPLC-MS/MS的检测结果，对样品中群感效应分子3-O-C6-HSL、3-O-C8-HSL、3-O-C10-HSL、3-O-C12-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL进行定性和/或定量判断。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述乙二胺四乙酸四钠的终浓度为1～5mmol/L。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述超声处理的条件包括：超声功率500～800W，工作4～6秒，间歇4～6秒，工作时间10～15min；超声时体系温度稳定控制在80℃～100℃。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，梯度洗脱参数：0min，A相达到设定的比例50％；0～3.0min，两种流动相均速变化使A相在40％～60％；3.0～6.0min，A相为60％～80％；6.0～10min，A相为80％～100％；10.0～12.0min，A相为100％～50％；上述均为体积百分比。


5.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括建立所述群感效应分子的标准曲线，根据标准曲线对样...

【专利技术属性】
技术研发人员：王尚，王景峰，赵辰，李辰宇，薛斌，张曦，杨晓波，邱志刚，谌志强，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12