一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，属于微生态肥料个性化定制的领域。本发明专利技术利用枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、光合菌等发酵菌液，有机肥、有机料、无机料、腐熟菌剂等经过科学配方而组成。通过对土壤样品的原有微生物菌群进行生物信息分析，优化和制定具有针对性的活性复合微生态菌肥配方，利用该菌剂配方对天然植物类进行发酵，在个性化配方下，构建的活性复合微生态菌肥。其作用是通过这些个性化菌液改善作物根系生态，优化作物营养吸收环境，从而使得连作作物正常生长并达到增产增收的效果。本发明专利技术不仅具有改良土壤、预防土传病害、分解土壤有毒物质、促进植株生长和提高植株抗逆能力的功效，还解决了传统单一的生产工艺，使资源进一步得到优化和良性循环，在现代农业领域中得到充分地精准应用，填补产业空白，是一种可以有效地解决葡萄连作障碍的微生态菌肥。

【技术实现步骤摘要】
一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用
本专利技术属于微生态有机肥料个性化定制的
，更具体地说，涉及一种微生物肥料动态配方的制定方法。
技术介绍
葡萄栽培历史悠久，分布面积大，全世界都有大面积的栽培，我国近几年葡萄栽培面积、产量增长速度明显高于其它果树，产业布局向优势区转移，设施栽培在非适宜区发展较快。但随着连作年限的增加，葡萄植株出现长势衰弱、病害蔓延，严重制约着葡萄产业的发展。因此，连作障碍已成为一个广泛存在、危害严重的生产性问题。引起连作障碍的主要原因之一就是根际土壤微生物种群数量和结构发生变化，葡萄连作后根际土壤细菌、放线菌的数量明显降低，真菌数量明显增加。但目前，解决连作障碍主要集中在种植方式的更改，如轮作或间作，并未从根本上解决问题。利用微生物组学分析和传统分离分析相结合指导开发一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，并把之前分析的结果和作物生长状况相结合对定制的个性化微生态菌肥的效果作出评估，从而改善解决葡萄连作障碍问题。本专利不仅具有改良土壤、预防土传病害、分解土壤有毒物质、促进植株生长和提高植株抗逆能力的功效，还解决了传统单一的生产工艺，使资源进一步得到优化和良性循环，在现代农业领域中得到充分地精准应用，填补产业空白，是一种可以有效地解决葡萄连作障碍的微生态菌肥。
技术实现思路
1.要解决的问题本专利的目的在于研发一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，很大程度上改善葡萄连作障碍情况，使葡萄种植土壤得到自我修复，减少化肥施用量，确保葡萄品质，改良土壤状况。2.技术方案为了解决上述问题，本专利技术一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，包括以下步骤所采用的技术方案如下：葡萄栽培土壤样本采集及处理：对目标区域进行测量，采用五点采样法进行采样，取样土层25-35厘米。样本经粗处理后，采取微珠打碎或者是超声的方法提取样本中的微生物DNA，采用荧光定量法测定DNA浓度。处理后纯化后，采用515F/806RPCR(515F-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT)引物对微生物DNA的16SrRNA基因的V3-V4高变区进行扩增。具体步骤详见本公司专利微生物肥料动态菌剂配方的配制方法和精准应用(专利号：2018103380602)，个性化微生态菌肥料制备方法流程图如图一所示；测定土壤中微生物总量及微生物菌群比例：使用MPBiomedicalsFastDNA土壤样品提取试剂盒，提取目标土壤中微生物的总DNA，然后以16SrRNA作为目标序列，使用515F/806RPCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品；通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序(测序长度可以到达双端500-600碱基，可以完全包括16S基因片段；可以同时对超过20000个样本的PCR扩增产物进行测定)，对测序结果进行分析评估，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例。确定菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与自主建立的葡萄种植土壤生物信息数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，确定葡萄种植土壤的个性化菌剂配方。若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)；若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)。发酵：所述的菌液发酵基质包括新鲜不同种类的天然植物块、茎、果实，(优选：白菜、土豆、南瓜、菠萝、库尔勒香梨、西红柿、甘蔗、西瓜各l0kg，)分别洗净、切块/粉碎(长度<1.5cm)并去除杂质后存放；按比例3：10(植物：水)加入纯净水及酵母浸膏5-10％。将步骤(3)中确定的个性化菌剂配方中的天然微生物活性菌群按比例以1:500稀释与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0时，则发酵成熟。将发酵液进行冷却，经过混匀，过滤分离，检测，调配，贮藏在无阳光直射、阴凉通风处。发酵成熟后，以有机肥为载体，进行混合。更进一步地，所述的步骤(1)中采取微珠打碎或者是超声的方法提取样本中的微生物DNA，采用荧光定量法测定DNA浓度。更进一步地，所述的步骤(1)中采用的515F/806RPCR引物为515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA806R；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。细菌16SrRNA基因共有V1，V2到V9共九个高变区。本专利技术中通过使用双端编码的515F/806RPCR引物，扩增16SrRNA基因的V3-V4高变区。扩增的产物通过Illumina或其他的测序平台进行高通量测序。16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，16SrRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列具有较完备的参考文库用以细菌分型分析。更进一步地，葡萄种植土壤中的微生物菌群包括光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群、发酵系的丝状菌群、双歧杆菌、芽孢杆菌、根瘤菌、生孢梭菌、木霉菌、黑曲霉菌、放线菌、解钾菌、解磷菌、地表球囊霉菌、固氮菌等多种菌群，按照葡萄具体生长环境和检测结果，动态复合菌种配制而成。更进一步地，通过选择葡萄种植土壤样本中常见多种菌株16SrRNA的微生物基因序列的测定，参照公共数据库(RDP、SILVA、GreenGene、UNITE)菌株的系统分类名称和DNA序列信息，自主构建葡萄种植土壤生物信息数据库分析和管理平台的方法。更进一步地，菌液发酵基质包括新鲜不同种类的天然植物块、茎、果实，(优选：白菜、土豆、南瓜、菠萝、库尔勒香梨、西红柿、甘蔗、西瓜各l0kg，)分别洗净、切块/粉碎(长度<1.5cm)并去除杂质后存放；按比例3：10(植物：水)加入纯净水及8-13％的蔗糖(优选：8％蔗糖)。更进一步地，将步骤(3)中确定的个性化菌剂配方中的天然微生物活性菌群按比例以1:500稀释与发酵基质进行混合发酵，设定发酵罐温度28℃，前1-3天完全密封，4-7天少量通气，使活性复合微生物充分进行扩增，发酵7天后，无大量气体产生时，重新密封发酵罐，以便杀灭病原菌、虫卵等，为了提高无害化处理程度，此阶段持十五至二十天(优选：18天)；在这个阶段由于温度上升，水分有所减少。发酵过程继续，并逐渐转化为比较稳定的微生态产品。当温度稳定后，当发酵基质的pH值到达或接近5.0时，则发酵成熟。更进一步地，将发酵液冷却至室温，并与与载体(已经腐熟有机肥)充分混匀，干燥，造粒制成定制的微生态菌肥。经检测，上述固态型微生态产品呈棕黑色，松软，pH5.0-8.5，12个月内各种配方菌总含量≥0.2×109cfu/g，符合标准。3.有益效果相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：(1)本专利通过对土壤样本的微生物菌群进行生物信息分析，优化和制定具有针对性的活性复合微生态菌肥配方，利用该菌剂配方对天然植物类进行发酵，构建个性化的活性复合微生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，包括以下步骤：/n(1)葡萄种植土壤样本采集及处理：对目标区域进行测量，采用五点采样法进行采样，取样土层25-35厘米。样本经粗处理后，采取微珠打碎或者是超声的方法提取样本中的微生物DNA，采用荧光定量法测定DNA浓度。处理后纯化后，采用515F/806R PCR引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V3-V4高变区进行扩增。具体步骤详见本公司专利微生物肥料动态菌剂配方的配制方法和精准应用(专利号：2018103380602)/n(2)测定目标区域土壤中微生物总量及微生物菌群比例：使用MP BiomedicalsFastDNA土壤样品提取试剂盒，测定目标土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例。/n(3)制定个性化菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与自主建立的葡萄种植土壤生物信息数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，确定葡萄种植土壤的个性化菌剂配方。若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×10...

【技术特征摘要】
1.一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，包括以下步骤：
(1)葡萄种植土壤样本采集及处理：对目标区域进行测量，采用五点采样法进行采样，取样土层25-35厘米。样本经粗处理后，采取微珠打碎或者是超声的方法提取样本中的微生物DNA，采用荧光定量法测定DNA浓度。处理后纯化后，采用515F/806RPCR引物对微生物DNA的16SrRNA基因的V3-V4高变区进行扩增。具体步骤详见本公司专利微生物肥料动态菌剂配方的配制方法和精准应用(专利号：2018103380602)
(2)测定目标区域土壤中微生物总量及微生物菌群比例：使用MPBiomedicalsFastDNA土壤样品提取试剂盒，测定目标土壤中微生物的总DNA，然后以16SrRNA作为目标序列，使用515F/806RPCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例。
(3)制定个性化菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与自主建立的葡萄种植土壤生物信息数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，确定葡萄种植土壤的个性化菌剂配方。若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)，若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)。
(4)发酵：将步骤(3)中确定的个性化菌剂配方中的天然微生物活性菌群按比例以1:500稀释与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0时，则发酵成熟。


2.根据权利要求1所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：所述的步骤(1)中采用采取微珠打碎或者是超声的方法提取样本中的微生物DNA，采用荧光定量法测定DNA浓度。


3.根据权利要求1或2所述的一种改善葡萄连作障碍的个性化微生态菌肥的制备方法和应用，其特征在于：所述的步骤(1)中采用的515F/806RPCR引物为515F-GTGCCAGCMGCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹星，吴欣圆，徐新燕，任淑媛，孙子茜，
申请(专利权)人：银川尧玥生物科技有限公司，南京尧玥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64