一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法和精准应用组成比例

本发明专利技术公开了一种微生物肥料菌剂配方的精准制定方法和精准应用，属于微生态肥料个性化定制的领域。本发明专利技术通过对土壤样品的原有微生物菌群进行生物信息分析，优化和制定具有针对性的活性复合微生物菌剂配方，利用该菌剂配方对天然植物类进行发酵，在个性化构建的活性复合微生物菌剂的作用下，对植物成分持续发酵升温，杀灭有害病原体的同时，使植物成分充分分解后腐熟，得到优质的生物肥料，解决了传统单一的生产工艺，使资源进一步得到优化和良性循环，在现代农业领域中得到充分地精准应用，填补产业空白，极大地符合我国国情，应用前景广阔。

Formulation method and precise application of a dynamic microbial inoculum formulation for microbial fertilizers

The invention discloses a precise formulation method and precise application of a microbial fertilizer microbial agent formula, belonging to the field of personalized customization of microecological fertilizers. By analyzing the original microbial flora of the soil sample, the invention optimizes and formulates the prescription of the pertinent active composite microbial agent, ferments the natural plants with the prescription of the microbial agent, and continuously ferments and promotes the plant components under the action of the individually constructed active composite microbial agent. Temperature, killing harmful pathogens at the same time, fully decompose the plant components and mature, get high-quality bio-fertilizer, solve the traditional single production process, further optimize the resources and virtuous cycle, in the field of modern agriculture has been fully and accurately applied to fill the industrial gap, greatly in line with China's national conditions. The application prospect is broad.

【技术实现步骤摘要】
一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法和精准应用
本专利技术属于微生态有机肥料个性化定制的
，更具体地说，涉及一种微生物肥料动态配方的制定方法。
技术介绍
生态肥料是有机固体废弃物(包括有机垃圾、秸秆、人、畜、禽粪便、饼粕、农副产品和食品加工产生的固体废弃物)经微生物发酵、除臭和完全腐熟后制作而成的有机肥料。富含多种功能性微生物和丰富的微量元素，可以改良土壤结构，对作物生长起到营养、调理和保健作用。但是目前的生态肥料发酵多采用单一菌种或盲目的(针对不同个体，菌群比例一成不变)复合菌种进行发酵，生态肥料的成分相对固定，不能满足不同地区的土质需求。例如，中国专利申请号为201410639199.2，申请公布日为2015年2月18日的专利申请文件公开了一种生态有机肥料，以动物粪便、废弃植物、秸秆粉、树叶粉、玉米面作为原料，添加发酵菌剂进行发酵，同时添加一些石膏粉、氮磷钾肥等进行调整。中国专利申请号为201510147305.X，申请公布日为2015年8月5日的专利申请文件也是公开了类似的技术方案。再例如某一专利技术专利(CN201610080592)应用固定不变的几个菌种组成及化学物质作为基质混合发酵农林作物的肥料。中国专利申请号为CN101168491A，申请公布日为2016年10月24日的专利申请文件也是公开了类似的技术方案。天然活性复合微生物菌种及其衍生物的微生态产品制备过程中，通过微生物发酵，能够提高产品的稳定性，免去添加任何化学试剂等危害。显著提高了农产品的品质/产量和土壤改良的效果(现代农业)，免去化学物质及添加剂等对人体造成的危害和提高精准应用的价值。在我国，耕地的60％以上存在着营养贫瘠的问题，生态肥料不仅能够提供农作物生长发育所需的各类营养元素，其中的功能性微生物施入土壤后，或能活化土壤中的养分，改善植物的营养环境，或在微生物的生命活动过程中，产生活性物质，刺激植物生长的特定微生物制品。每个区域的土壤性质(原有的微生物种类、含量等)都不相同，固定单一的生态肥料配方无法满足不同地区的土壤需求，目前还缺少如何根据土壤性质的不同，个性化提供生态肥料的菌剂配方，发酵得到性能稳定的肥料的方法。
技术实现思路
1.要解决的问题针对现有生物肥料功能单一、没有针对性等问题，本专利技术提供一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，根据不同区域内的土壤微生物分布情况确定独特的微生物菌剂配方，对天然植物进行发酵得到合适的微生物肥料，微生物菌剂配方依据土壤的性质来制定，具有针对性和独特性。2.技术方案为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，包括以下步骤：(1)土壤样本处理：抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806RPCR(515F-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT)引物对微生物DNA的16SrRNA基因的V4高变区进行扩增；16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，16SrRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列具有较完备的参考文库用以细菌分型分析。(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16SrRNA作为目标序列，使用515F/806RPCR引物通过定量即时PCR对总的微生物菌群进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品；(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序(测序长度可以到达双端500～600碱基，可以完全包括16S基因片段；可以同时对超过10000个样本的PCR扩增产物进行测定，极大地降低单个样本的测序价格，清除价格瓶颈)，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16SrRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；(4)确定菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与该地区的土壤微生物数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)；若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)；所述微生物菌群的菌种均来自于筛选出的大自然环境的天然菌种；(5)生物肥料发酵：将步骤(4)中确定的菌剂配方与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0，则发酵成熟，将发酵液进行冷却，经过混匀，过滤分离，检测，调配，贮藏在无阳光直射、阴凉通风处。更进一步地，所述的步骤(1)中采用微珠打碎和/或超声(130W×20KHz)的方法来提取样本中的微生物DNA，使用荧光法测定DNA浓度。更进一步地，所述的步骤(1)中采用的515F/806RPCR引物为515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA806R；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。细菌16SrRNA基因包含从V1，V2到V9共九个高变区。本专利技术中通过使用双端编码的515F/806RPCR引物，扩增16SrRNA基因的V4高变区。扩增的产物通过Illumina或其他的测序平台进行高通量测序。更进一步地，土壤中的微生物菌群包括光合菌、硝化细菌、乳酸菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、木霉菌、黑曲霉菌、放线菌、解钾菌、解磷菌、固氮菌。更进一步地，16SrRNA的微生物基因序列数据库的构建方法为：通过对公共数据库(RDP、SILVA、GreenGene、UNITE等)中细菌遗传信息筛选选择土壤样本中常见几百种菌株的约1.8kb大小的16SrRNA基因的DNA序列，数据库中包括菌株的详细系统分类名称和DNA序列信息。更进一步地，土壤微生物数据库的建立方法为通过高通量16SrRNA基因测序获得某一地区的大量土壤样本中微生物组成分布比例信息，如图2所示。更进一步地，所述的发酵基质包括无毒植物块、茎、果实，包括蔬菜、水果、根茎、菌类植物、子实体及本草类，发酵基质要经过洗净、切块/粉碎(长度<1.5cm)并去除杂质(铁丝、石块、塑料、泥块、肉类、油类等)。更进一步地，发酵基质中包括70％的水和5～8％的蔗糖，质量分数。更进一步地，所述的蔗糖是一种没有经过高度精炼的、带蜜成型的、颜色比较深的甘蔗成品糖，主要是指黑糖和红糖。更进一步地，步骤(5)中发酵过程为：在25～30℃的温度下发酵，活性复合微生物进行营养和繁殖，发酵7d后，没有大量气体产生时，密封发酵罐，以便杀灭病原菌、虫卵等，为了提高无害化处理程度，这个阶段至少保持15-20d；在这个阶段由于温度上升，水分有所减少。发酵过程继续，并逐渐转化为比较稳定的微生态产品(即本专利技术中的生物肥料的主要成分)。当温度稳定后，且pH到达或接近5.0时显示发酵成熟，并冷却；发酵结束，过滤分离得到固态型和液态型两种微生态产品，即为本专利技术中的微生物肥料。经检测，上述固态型微生态产品呈黄色，松软；液态型微生态产品呈棕黄色；pH5.0-7.5，12个月内各种配方菌总含量≥109cfu/g(mL)，符合标准。3.有益效果相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术通过对土壤样本的微生物菌群进行生物信息分析，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，包括以下步骤：(1)土壤样本处理：抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806R PCR引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V4高变区进行扩增；(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品；(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16S rRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；(4)确定菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与该地区土壤微生物数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)；若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)；(5)微生物肥料发酵：将步骤(4)中确定的菌剂配方与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0时，则发酵成熟。

【技术特征摘要】
1.一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，包括以下步骤：(1)土壤样本处理：抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806RPCR引物对微生物DNA的16SrRNA基因的V4高变区进行扩增；(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16SrRNA作为目标序列，使用515F/806RPCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品；(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16SrRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；(4)确定菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与该地区土壤微生物数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)；若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)；(5)微生物肥料发酵：将步骤(4)中确定的菌剂配方与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0时，则发酵成熟。2.根据权利要求1所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的步骤(1)中采用微珠打碎和/或超声的方法来提取样本中的微生物DNA。3.根据权利要求1或2所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的步骤(1)中采用的515F/806RPCR引物为515F-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT。4.根据权利要求1所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：土壤...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹星，胡建中，
申请(专利权)人：银川尧玥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64